Iskusstvennye mikrovezikuly iz stvolovykh i opukholevykh kletok cheloveka: poluchenie, biologicheskie svoystva i potentsial'noe terapevticheskoe primenenie

Abstract

Full Text

ВВЕДЕНИЕ. Микровезикулы - высвобождаемые клетками человека мембранные везикулы, которые содержат белки, нуклеиновые кислоты, липиды и опосредуют межклеточную коммуникацию в организме человека (Baglio et al., 2015). Микровезикулы проявляют биологические свойства родительских клеток. Риски клеточной терапии, связанные с онкотрансформацией, привели к развитию концепции бесклеточной терапии, перспективным инструментом которой являются микровезикулы. Однако развитие клинических протоколов сдерживает ограниченный выход микровезикул. С целью увеличения выхода микровезикул, мы применили метод обработки клеток человека цитоха-лазином В (Picket al., 2005). Цитохалaзин В приводит к дезорганизации актинового цитоскелета клетки, имитируя действие Ca2 + -зависимого фермента кальпаина (Pudduet al., 2010; Morel et al., 2011). Целью нашей работы явилась характеристика и оценка биологической активности индуцируемых с помощью цитохалазина В микровезикул, или искусственных микровезикул (иМВ). РЕЗУЛЬТАТЫ. Так как мишенью действия цито-халазина В являются актиновые микрофиламенты, мы исследовали структуру актинового цитоскелета в клетках-донорах и наличие молекул актина в составе иМВ. Методом конфокальной микроскопии и иммуноблотинга нами было показано, что в иМВ происходит включение фрагментов актиновых ми-крофиламентов. Известно, что в процессе образования естественные микровезикулы клеток человека также захватывают фрагменты актиновых микрофи-ламентов, что является отличительным признаком микровезикул (Antonyak et al., 2011; Kawamoto et al., 2012). Методом электронной микроскопии было установлено, что размер иМВ SH-SY5Y составляет от 100 нм до 1800 нм с пиком в области 100600 нм. С целью исследования проявляют ли иМВ биологические свойства клеток-доноров была оценена ангиогенная активность иМВ клеток линии SH-SY5Y, которые известны своей способностью стимулировать ангиогенез (Rizvanov et al., 2010). В результате проведенных исследований установлено, что иМВ стимулируют формирование капилля-ро-подобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) in vitro подобно клеткам-донорам SH-SY5Y. При подкожном введении в матриксе Matrigelin vivo иМВ стимулируют прорастание кровеносных капилляров, плотность которых на единицу площади гистологического среза статистически значимо (значение p<0,01) превышала контрольный образец (подкожная инъекция матрикса Matrigel) в 12,7 раз. ВЫВОДЫ. Размер получаемых иМВ сопоставим с размером естественных микровезикул. Проявление иМВ биологической активности родительских клеток свидетельствует о возможности безопасного и эффективного использования регенеративного и ангиогенного потенциала иМВ стволовых, эндотелиальных прогениторных клеток и др. Применение цитохалазина В позволяет увеличить выход иМВ и сделать процедуру выделения и очистки промышленно применимой. Это, в свою очередь, будет способствовать развитию подходов с применением иМВ для терапии ишемических повреждений нижних конечностей, инсульте, инфаркте.