ISSLEDOVANIE ANGIOGENNYKh SVOYSTV PLAZMIDY, KODIRUYuShchEY GENY SDF-1α I VEGF165 IN VITRO

Abstract

Full Text

Фактор стромальных клеток 1а (SDF-1a) и сосудистый эндотелиальный фактор роста 165 (VEGF165) играют важную роль в ангиогенезе и выполняют трофическую функцию. SDF-1a является хемоаттрактантом для эндотелиальных кле-ток-предшественников из костного мозга через CXCR4-зависимый механизм и способствует формированию новых кровеносных сосудов. VEGF165 обладает нейропротекторными, нейротрофическими и про-ангиогенными свойствами. В настоящее время активно исследуется возможность применения данных факторов роста для регенеративной медицины. В настоящем исследовании проанализирован анги-огенный потенциал плазмиды pBud(Kan)-VEGF1 65-SDF-1a, одновременно экспрессирующей VEGF165 и SDF-1a. Для исследования ангиогенного потенциала использовали кондиционированную среду мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани человека (МСК-ЖТ) и НЕК293Д трансфицированных плазмидой pBud(Kan)-VEGF165-SDF-1a. Экспрессия рекомбинантных белков VEGF165 и SDF-1a в трансфицированных клетках была подтверждена иммунофлуоресцентным анализом, ИФА и имму-ноблоттингом. Было показано, что кондиционированная среда клеток HEK293T, трасфицированных плазмидой pBud(Kan)-VEGF165-SDF-1a стимулирует формирование капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками из пупочной вены человека HUVEC на Матригеле in vitro. Также проведен ана лиз пролиферативной активности клеток HUVEC при культивировании с добавлением 30% кондиционированной среды клеток HEK293T, трасфицирован-ных плазмидой pBud(Kan)-VEGF165-SDF-1a. Методом MTS-теста показано, что кондиционированная среда трансфицированных клеток HEK293T на 30% повышает пролиферативную активность клеток HUVEC по сравнению с нетрансфицированными клетками. Уровень продукции цитокинов/хемокинов INF-у, IL-1 ß, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, MCP-1 оценивали на мультиплексном анализаторе Luminex200 с использованием микросфер MILLIPLEXMAP. Концентрации аналитов были рассчитаны с использованием стандартной кривой, с помощью программного обеспечения LuminexIS 2.3. Было показано, что генетическая модификация МСК-ЖТ плазмидой pBud(Kan)-VEGF165-SDF-1a приводила к значительному повышению концентрации IL-8 (10814 пг/мл) и MCP-1 (23812 пг/мл) в культуральной среде по сравнению с нетрансфицированными клетками (1588 и 4954,5 пг/мл). IL-8 известен как сильный индуктор ангиогенеза. По литературным данным рекомбинантный IL-8 стимулирует выживание и пролиферацию клеток HUVEC, а также продукцию матриксных металлопротеиназ ММР-2 и 9. MCP-1-индуцированный ангиогенез опосредуется через каскад реакций с участием VEGF165 и активацией белка RhoA. Этим можно объяснить повышение уровня MCP-1 в культуральной среде генетически модифицированных МСК-ЖТ. Таким образом, плазмида pBud(Kan)-VEGF165-SDF-1a проявляет ангиогенные свойства в культуре клеток in vitro. В связи с большим интересом к разработке невирусных технологий для регенеративной медицины, данная плазмида, одновременно экспрессирующая VEGF165 и SDF-1a, может лечь в основу новых методов стимуляции терапевтического ангиогенеза.