Primenenie razlichnykh metodov vital'nogo fluorestsentnogo okrashivaniya dlya issledovaniya samoorganizatsii stromal'nykh i opukholevykh kletok

Abstract

Full Text

Исследование самоорганизации стромальных и опухолевых клеток в ко-культуре актуально для понимания процессов, происходящих в стромальном микроокружении опухоли, которое играет ключевую роль в процессах развития опухоли и ее прогрессии, метастазирования и формирования устойчивости к химио- и лучевой терапии. Для оценки поведения клеток в ко-культуре, их взаимодействий и последующего анализа отдельных клеточных популяций используют различные методы флуоресцентного витального окрашивания. В настоящей работе проведен сравнительный анализ различных методов флуоресцентного окрашивания для анализа самоорганизации мезенхимных стромальных клеток (МСК) и опухолевых клеток SH-SY5Y в ко-культуре. МСК выделяли из костного мозга человека методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла с последующей адгезией к пластику. МСК и SH-SY5Y перед внесением в смешанную культуру были предварительно окрашены мембранными красителями VybrantDiD (красный) и DiO (зеленый). После окрашивания клетки культивировали на пластике, покрытом желатином, при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2. Самоорганизацию клеток анализировали через 48 ч. инкубации. Цитофлуо-риметрический анализ отдельных клеточных популяций после 120 ч. совместного культивирования проводили на приборе FACSAriaIII. После витального окрашивания МСК и SH-SY5Y имели красную и зеленую флуоресценцию, что позволяло легко различить данные клеточные типы в ко-культуре. При совместном культивировании в течение 48 ч. МСК и SH-SY5Y на пластике, покрытом желатином, клетки SH-SY5Y образовывали островки в монослое МСК, которые, в свою очередь, формировали каналоподобные структуры. Цитофлуориметрический анализ показал высокую степень обмена мембранными компонентами между МСК и SH-SY5Y, что приводило к смешению спектров флуоресценции клеток в ко-культуре. Кроме того, окрашенные клетки в процессе деления теряли мембранный краситель, что затрудняло визуализацию при длительном культивировании. Таким образом, не целесообразно использование мембранных флуоресцентных красителей для исследования самоорганизации клеток при длительном культивировании. В качестве альтернативного метода флуоресцентного витального окрашивания использовали трансдукцию клеток лен-тивирусами (LV), кодирующими красный (RFP) или зеленый (GFP) флуоресцентные белки. Для получения LV использовали ко- трансфекцию пакующей линии клеток HEK293T тремя плазмидами: векторной (pLX303-RFP или pLX303-GFP), оболочечной psPAX2 и упаковочной pCMV-VSV-G. МСК и SH-SY5Y транс-дуцировали полученными LV с MOI 10. Для получения стабильных линий МСК-RFP и SH-SY5Y-GFP, экспрессирующих красный и зеленый флуоресцентные белки, через 72 ч. после трансдукции клетки сортировали по красной или зеленой флуоресценции. Отмечено, что при длительном культивировании МСК-RFP и SH-SY5Y-GFP не теряли флуоресценцию. Таким образом, лентивирусная трансдукция для витального флуоресцентного окрашивания клеток является целесообразным методом визуализации клеток в ко-культуре.