VLIYaNIE NIZKIKh KONTsENTRATsIY KISLORODA NA PROTsESS SPONTANNOY DIFFERENTsIROVKI MSK V KUL'TURE

Abstract

Full Text

Подбор условий культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) in vitro для получения необходимого объема клеточной биомассы путем пассирования, при которых клетки смогут реализовать свой пролиферативный потенциал, сохранив при этом высокую жизнеспособность и мультипо-тентность, что определяет их пригодность для применения в регенеративной медицине и клеточной терапии, крайне актуален. Как известно, использование физиологически низких концентраций О2 при культивировании является оправданной стратегией для экспрессного наращивания биомассы МСК, т.к. способствует повышению пролиферативной активности и жизнеспособности клеток с сохранением диффе-ренцировочного потенциала. Вместе с тем, явление спонтанной дифференцировки МСК при различных условиях культивирования и молекулярные механизмы данного процесса остаются мало изученными. Целью настоящей работы явилось изучение влияния гипоксии (5% О2) на спонтанную дифференциров-ку МСК жировой ткани (ЖТ) в остеогенном и хон-дрогенном направлениях. МСК ЖТ культивировали в стандартных условиях (5% СО2, 95% атмосферного воздуха) до 2 пассажа в среде а-МЕМ с 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). В экспериментах использовали клетки c типичным для МСК фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-. На 3 пассаже МСК переводили в гипоксические условия (5% СО2, 5% О2, 90% N2) и культивировали в монослое в среде а-МЕМ с 2% ФБС без добавления специфических индукторов в течение 14 сут. Смену среды проводили каждые 3 сут. Экспрессию генов маркеров предшественников остеоцитов (щелочная фосфатаза, остеопонтин, остеокальцин) и хондро-цитов (коллаген 1, 2, 9, 10 типов, Sox9, аггрекан), а также генов белков p53 и c-Myc проводили с использование ПЦР в реальном времени. Обнаружено, что при культивировании МСК ЖТ в течение 14 сут. в условиях 5% содержания О2 экспрессия гена осте-опонтина в клетках не отличалась от таковой при 21% О2, а экспрессия гена щелочной фосфатазы снижалась в 1,7 раза (p<0,5). Также установлено, что экспрессия гена такого важного для хондроген-ной дифференцировки транскрипционного фактора как Sox9 и экспрессия гена компонента внеклеточного матрикса аггрекана при гипоксии была ниже в 2 раза (p<0,5), чем при нормоксии. При этом уровень экспрессии коллагена 1 и 10 типов не имел статистически значимых различий. Экспрессия гена одного из поздних маркеров предшественников остеоцитов остеокальцина, а также генов коллагена 2 и 9 типов не была выявлена в МСК ЖТ ни при одном кислородном режиме культивирования. При изучении экспрессии генов транскрипционных факторов p53 и c-Myc, участвующих в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки, в МСК ЖТ, культивированных при 5% О2, было выявлено ее снижение в 1,3 и в 2,7 раза, соответственно. Полученные данные дают основание полагать, что культивирование МСК ЖТ в условиях 5% гипоксии снижает риск их спонтанной остео- и хондрогенной дифференцировки наряду с сохранением высокой пролиферативной активности и жизнеспособности.