Optimizatsiya instrumentov genomnogo redaktirovaniya dlya polucheniya kletochnykh modeley bolezni Khantingtona

Abstract

Full Text

Болезнь Хантингтона - это наследственное ней-родегенеративное заболевание человека, причиной которого является динамическая мутация удлинения тракта тринуклеотидных повторов CAG в кодирующей части первого экзона гена HTT (Huntingtin). Экспрессия мутантного аллеля приводит к синтезу токсичной формы белка mHTT, имеющей удлинённый по-лиглутаминовый тракт (более 35 а.о.) и склонной к образованию агрегатов внутри клетки. Однако механизм патологического действия mHTT, приводящий к нейродегенеративным изменениям в специфических областях головного мозга, остается слабо изученным. Моделирование наследственных заболеваний человека in vitro имеет большие перспективы в современной биомедицине. Используя методы редактирования генома, можно создавать панели изогенных клеточных линий, различающихся между собой лишь мутациями в определенных генах, ответственных за развитие заболевания. При этом исходные клетки, не несущие мутации, будут являться идеальным «здоровым» контролем. Нами были разработаны и успешно применены молекулярные инструменты на основе CRISPR/Cas9, позволяющие вносить удлиненный тракт повторов CAG в первый экзон гена HTT культивируемых клеток. Спейсерная последовательность CRISPR/Cas9 обеспечивает узнавание и гидролиз геномной ДНК на расстоянии 37 нуклеотидов от начала тракта тринуклеотидных повторов. Создан набор донорных молекул, несущих 69 и 148 повторов CAG, фланкированных плечами гомологии к первому экзону гена НТТ. Для предотвращения разрезания донорной молекулы ДНК и повторного гидролиза геномной ДНК рекомбинантного аллеля в донорную последовательность была внесена однонуклеотидная замена, которая изменяет район узнавания Cas9 PAM с AGG на AAG. Данная замена в то же время является синонимичной, т. е. не изменяет аминокислотную последовательность белка (кодон CTG меняется на TTG (Leu)). При выборе нуклеотида для замены учитывалась частота использования кодонов. Эффективность работы созданной системы редактирования генома была успешно подтверждена на клетках линии НЕК293FТ. Получены клоны единичных клеток, гомо- и гетерозиготных по вносимой мутации. Секвенирование подтвердило внесение тракта повторов и синонимичной замены в геном клеток. Разработанная нами система позволяет использовать ДНК-пробы для детекции внесения целевой мутации, что облегчает работу с культурами клеток, с трудом поддающихся субклонированию, таких как плюрипотентные стволовые клетки, нейробластома человека, культуры нейрональных предшественников.