Novaya model' dlya izucheniya protsessov reparatsii in VITRO na osnove lazernoy mikrodissektsii kletochnykh sferoidov

Full Text

Направленные на восстановление повреждений процессы регенерации и репарации происходят на всех уровнях организации - клеточном, тканевом, органном, организменном. Процессы репарации активно изучают на различных модельных системах как in vivo на животных, так и in vitro. Клеточные культуры - это одна из простейших моделей в системе in vitro. Культивирование в трехмерных системах позволяет поддерживать физиологические свойства и пролиферативную активность клеток в условиях, приближенных к in vivo. Целью исследования стало создание новой доступной воспроизводимой модели для изучения процессов репарации in vitro с использованием клеточных сфероидов и современных методов лазерной микрохирургии. Исследование проведено на сфероидах из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) и из дермаль-ных фибробластов (ФБ) человека. Сфероиды получали на агарозных планшетах с лунками (Microtissue, США) и повреждали наносекундным лазерным диссектором PalmCombiSystem (Zeiss, Германия). Параметры лазерного излучения (длина волны 355 нм, частота импульсов 100 Гц, длительность импульсов 2 нс, максимальная энергия в импульсе 9 мкДж, время воздействия 10-30 с.) оптимизировали для эффективной микродиссекции заданной области поверхностной и внутренней зон сфероида. Наблюдение за процессом репарации проводили, используя прижизненную цейтраферную фотосъемку в системе Cell-IQ (CMTechnologies, Финляндия). Через 1, 6, 24, 72 и 168 часов сфероиды анализировали с применением методов световой, флуоресцентной и растровой электронной микроскопии. За 7 сут. в 3D культуре ММСК и ФБ формировали жизнеспособные плотные сфероиды. В составе сфероидов выделяли две области - 2-4 слоя поверхностных уплощенных плотно прилегающих друг к другу клеток и внутренняя зона с полигональными клетками и внеклеточным матриксом. В течение 3 мин. после воздействия лазерных импульсов наблюдали спонтанное раскрытие краев разреза на угол более Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине 135 180°. Повреждение вызывало гибель клеток в месте разреза, нарушалась исходная структура сфероидов, форма клеток раневой поверхности менялась с вытянутой уплощенной на округлую. В незатронутой повреждением части сфероидов сохранялось строение с уплощенными поверхностными клетками и полигональными клетками внутренней зоны. Через сутки наблюдали частичное восстановление сфероидов, клетки в поверхностных слоях начинали распластываться. Восстановление исходной структуры сфероидов с характерными несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны происходило без пролиферации через 7 сут. после микро-диссекции за счет перестройки выживших клеток. Разработанная модель повреждения клеточных сфероидов с применением лазерной микродиссекцией открывает новые возможности для изучения механизмов регенерации и репарации in vitro.

About the authors

N. V Kosheleva

Email: n_kosheleva@mail.ru

I. N Saburina

I. V Il'ina

I. M Zurina

A. A Gorkun

T. D Kolokol'tsova

D. S Sitnikov

A. V Ovchinnikov

M. B Agranat

V. S Repin

References

Supplementary files