Issledovanie vzaimodeystviy CD14+ monotsitov so stromal'nymi i opukholevymi kletkami cheloveka pri sovmestnom kul'tivirovanii in vitro

Abstract

Full Text

Известно, что большинство опухолей активно взаимодействуют с моноцитами/макрофагами для создания микроокружения, которое способствует ангиогенезу и метастазированию опухоли, а также подавляет врожденный и адаптивный иммунный ответ. Однако многие аспекты активности данных клеток при онкологических процессах остаются невыясненными. Во время прогрессирования опухоли, циркулирующие моноциты и макрофаги активно привлекаются в опухоль, где они изменяют микроокружение опухоли для ускорения ее прогрессии. Макрофаги способны изменять свой функциональный фенотип в ответ на различные сигналы микроокружения, генерируемые стромальными и опухолевыми клетками. Исследование взаимодействия моноцитов с опухолевыми и стромальными клетками важно для разработки новых методов диагностики и лечения онкологических заболеваний человека. В настоящей работе проанализировано взаимодействие CD14+ моноцитов человека с мезенхимными стромальны-ми клетками (МСК) и опухолевыми клетками HeLa в ко-культуре in vitro. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. МСК были выделены из жировой ткани человека по стандартному протоколу путем ферментации жировой ткани 0,2% раствором коллагеназы краба. CD14+ моноциты получали путем магнитной сепарации из периферической крови здорового донора с использованием набора EasySepHumanCD14 PositiveSelectionKit (StemCellTechnologiesInc). Перед внесением в ко-культуру клетки окрашивали витальными флуоресцентными красителями: VybrantDiD (красный) для МСК, DiI (оранжевый) для HeLa и CMFDA (зеленый) для моноцитов. После 72 ч. совместного культивирования отдельные клеточные популяции разделяли путем трипсинизации и сортировки в зависимости от спектра флуоресценции и размера клеток на проточном цитофлуориметре FACSAriaIII (BDBiosciences). Жизнеспособность клеточных популяций после сортировки анализировали MTS-тестом. РЕЗУЛЬТАТЫ. Цитофлуориметрический анализ отдельных клеточных популяций после 72 ч. совместного культивирования CD14+ моноцитов с МСК или клетками HeLa показал активный обмен мембранными компонентами между различными типами клеток. В ко-культуре CD14+ моноцитов с HeLa процент клеток со смешанным спектром флуоресценции составлял 38,5%, а в ко-культуре с МСК - 25,3%. MTS-тест показал значительное снижение жизнеспособности клеток HeLa после совместного культивирования с моноцитами (на 36% по сравнению с монокультурой). Интересно, что совместное культивирование CD14+ моноцитов с МСК повышало жизнеспособность стромальных клеток на 46% по сравнению с монокультурой. При этом отмечено снижение жизнеспособности CD14+ моноцитов после совместного культивирования с МСК (на 65% по сравнению с контролем). Таким образом, показана принципиальная возможность совместного культивирования CD14+ моноцитов со стромальными и опухолевыми клетками человека. Разработанная система может быть использована для исследования молекулярных и клеточных механизмов взаимодействия различных популяций опухолевого микроокружения in vitro.