EFFEKTIVNYY SPOSOB CRISPR/CAS9-OPOSREDOVANNOGO VYKLYuChENIYa GENOV V KLETOChNYKh POPULYaTsIYaKh S NESTABIL'NYM KARIOTIPOM

Full Text

Клеточные линии являются удобной модельной системой для выяснения роли отдельных белков в развитии и патогенезе различных заболеваний. Для установления роли конкретного белка с помощью генетических методов, как правило, изменяют уровень синтеза белка интереса путем, в частности, увеличения уровня экспрессии кодирующего белок гена, либо, наоборот, снижения экспрессии гена или полного выключения синтеза белка путем генетического нокаута. Прицельное выключение конкретных генов, например с использованием технологии CRISPR/Cas9, достаточно просто, если модифицируемые клетки являются гаплоидными или диплоидными. Однако большинство популярных клеточных линий (HEK293, 3T3, HeLa, HepG2, Neuro2a и т.д.) характеризуются нестабильным кариотипом, т.е. различным количеством хромосом и числом копий генов (от 1 до 5 копий на клетку). Множественные копии генов практически невозможно выключить за один раунд генетической модификации, а разное количество генов в отдельных клетках делает популяции, полученные из них гетерогенными. Помимо этого, использование популяций клеток, происходящих из отдельных клонов, требует тщательной проверки на отсутствие нежелательных модификаций в геноме (т.н. off-target модификаций), поскольку все изменения в геноме, в том числе и нецелевые, будут содержать все клетки клона. В то же время, если клеточную популяцию получать, используя модификацию сразу большого числа клеток, минуя этап клонирования, влияние различной копийности генов и каждой конкретной нецелевой модификации генома не будет заметно из-за немногочисленности таких клеток в общем пуле. Однако выключение экспрессии генов в большой (многочисленной) популяции клеток с помощью CRISPR/Cas9 - это нетривиальная задача. В результате одного раунда трансфекции линий клеток (HEK293, 3T3, HeLa, HepG2, Neuro2a) плазмидой pX458, содержащей гены wtSpCas9, флуоресцентного маркера GFP и направляющей РНК (gRNA) к генам интереса, с последующим обогащением трансфицированных клеток по флуоресценции GFP, модификации подвержены лишь 20-50% аллелей. Целью данной работы было разработать эффективный и воспроизводимый протокол CRISPR/Cas9-опосредованной генной модификации популяции клеток, минуя этап клонирования. С помощью 2-3 циклов модификации с последующим обогащением по GFP нам удалось получить популяции клеток с выраженным (практически полным) подавлением экспрессии целевых генов. У полученных таким образом популяций клеток не наблюдали увеличения частоты нецелевой модификации ДНК. Получена новая информация о целесообразности применения различных вариантов системы модификации генома CRISPR/Cas9 в данном протоколе. Созданный протокол позволяет эффективно выключать гены в клеточных линиях с нестабильным кариотипом (HEK293, 3T3, HeLa, HepG2, Neuro2a) или в клеточных линиях, клонирование которых затруднено (HepG2).

About the authors

M. N Karagyaur

Email: m.karagyaur@mail.ru

P. A Vasil'ev

D. T Dyykanov

K. D Rysenkova

E. V Semina

K. Yu Kulebyakin

P. A Tyurin-Kuz'min

N. A Aleksandrushkina

A. A Shmakova

Yu. P Rubtsov

References

Supplementary files