SOKhRANENIE I PODDERZhANIE EPITELIAL'NOGO FENOTIPA KLETOK V 3D KUL'TURE

Abstract

Full Text

Обратимые переходы эпителия в мезенхиму (ЭМП) играют ключевую роль в эмбриогенезе, нормальной и патологической регенерации. Повреждения эпителиальных выстилок, в условиях хронических воспалительных процессов, способствуют формированию соединительнотканных рубцов, необратимо нарушают структуру и функцию органов. Поэтому восстановление эпителиальных выстилок является одной из первоочередных задач регенеративной медицины. В стандартных условиях 2D культуры эпителиальные клетки уже после первого пассажа начинают проходить ЭМП, что не позволяет получать большие количества эпителиальных клеток. ЦЕЛЬ. Изучение возможности поддержания эпителиального фенотипа клеток в условиях 3D культуры. Использовали два типа эпителия - первичные культуры клеток буккального эпителия (БЭ) слизистой ротовой полости и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Клетки культивировали до 4 пассажа в стандартных 2D условиях ( + 37°С, 5% СО2). 3D культивирование осуществляли в агарозных планшетах, полученных при помощи 3DPetriDish (Microtissue, США). Цейтраферную фоторегистрацию культур осуществляли на приборе Cell-IQ (CMTechnologies, Финляндия). Для анализа экспрессии маркеров применяли методы проточной цитометрии и иммуноцитохимии. Структурный и ультраструктурный анализ был проведен с применением методов гистологии и электронной микроскопии. В условиях 2D культуры клетки БЭ 1 пассажа имели морфологию «булыжной мостовой» и эпителиальный фенотип (ZO1 +, CK19 + , EpCAM + ). На 4 пассаже в культуре БЭ наблюдали признаки ЭМП и появление клеток со смешанным и мезенхимным фенотипом: экспрессия EpCAM снижалась с 94% до 50%, экспрессия NCAM и CD44 возрастала с 9,9% до 85% и с 25% до 90%, соответственно. В первичной 2D культуре ПЭС наравне с эпителиальным фенотипом (ZO1+) уже на 1 пассаже наблюдали признаки ЭМП - ко-экспрессию Е- и N-кадгеринов. На 2 пассаже количество клеток с мембранной локализацией ZO1 снижалось, в цитоплазме экспрессировался виментин - маркер мезенхимных клеток. В условиях 3D культуры клетки БЭ и ПЭС за 7сут формировали плотные жизнеспособные сфероиды. 3D культивирование клеток БЭ 2-4 пассажа способствовало восстановлению и поддержанию эпителиального (ZO1+, CK19 + ) фенотипа клеток в сфероидах. В 3D культурах ПЭС восстановление признаков эпителиальных клеток наблюдали в сфероидах из клеток 2 пассажа, тогда как в сфероидах из клеток 4 пассажа происходило лишь частичное восстановление фенотипа - между клетками формировались единичные плотные (ZO1+) и адгезионные (Е-кадгерин+) контакты. Таким образом, эпителиальные клетки, полученные из разных источников, исходно обладают разным потенциалом к ЭМП, их пластичность тканеспецифична. 3D культивирование позволяет поддерживать популяцию эпителиальных клеток. При сдвиге статуса исходных клеток в монослойной культуре от эпителиального к мезенхимному, снижается возможность вернуться в 3D культуре к полноценному эпителиальному фенотипу.