Poluchenie geneticheski-modifitsirovannoy linii plyuripotentnykh stvolovykh kletok cheloveka, ekspressiruyushchey HIF-faktor, indutsiruemyy gipoksiey

Full Text

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) человека обычно культивируют при атмосферной концентрации кислорода, в то время как развитие ранних эмбрионов, из которых получают ПСК, происходит в гипоксических условиях при концентрации кислорода 3-5%. Культивируемые ПСК человека значительно отличаются по профилю экспрессии генов от клеток внутренней клеточной массы раннего эмбриона. Предполагают, что определенный вклад в различия между клетками внутренней клеточной массы и получаемыми из них ПСК могут вносить условия культивирования, в частности, концентрация кислорода в среде. Во всех типах клеток ответ на гипоксию опосредуется транскипционным фактором HIF (Hypoxia-induciblefactor). Активируемые HIF сигнальные каскады вовлечены в процессы развития, метаболизма, реакции воспаления и ряд других физиологических процессов, в том числе играют ключевую роль в регуляции ангиогенеза. В настоящее время модуляция HIF-пути является перспективной терапевтической стратегией для управления различными заболеваниями. Целью данной работы является получение генетически-модифицированной линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека со стабильной экспрессией HIF-2a в нормоксических условиях, реализованной посредством сайленсинга его ингибитора INT6/eIF3 с использованием системы CRISPR/Cas9. Чтобы произвести сайленсинг INT6/eIF3, последовательности направляющих РНК подобраны таким образом, чтобы получалась делеция участка гена размером 200 п.н., включающая точку старта транскрипции и начало первого экзона INT6/eIF3. Полученные генетические конструкции доставлены в ИПСК человека линии iMA-1L с помощью нуклеофекции. Наличие требуемой делеции в полученных субклонах ИПСК подтверждено секвенированием. По результатам количественной ПЦР в режиме реального времени, уровень экспрессии INT6/eIF3 в генетически-модифицированных субклонах достоверно снижен более чем в 3 раза. При этом уровень экспрессии HIF-2α достоверно повышен по сравнению с контрольной линией ИПСК. Полученные генетически-модифицированные ИПСК будут использованы для исследования влияния активации HIF-2a в нормоксических условиях на ангиогенные свойства их эндотелиальных производных. Результаты данного исследования внесут значительный вклад в понимание фундаментальных молекулярных механизмов HIF-зависимого ангиогенеза, расширят представления Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 98 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине о сигнальных каскадах, запускаемых при целевой активации HIF, что необходимо для разработки перспективных терапевтических стратегий управления различными заболеваниями, такими как ишемические поражения любой этиологии и онкология.

About the authors

I. S Zakharova

Email: zakharova@bionet.nsc.ru

A. M Smirnova

M. K Zhiven'

A. I Shevchenko

E. V Grigor'eva

E. A Elisafenko

S. M Zakiyan

References

Supplementary files