Vydelenie i kharakteristika progenitornykh kletok serdtsa dlya biomeditsinskikh issledovaniy

Abstract

Full Text

В соответствии с рекомендациями регуляторных организаций Европейского Союза и США (EMA и FDA) для доклинических исследований терапевтической эффективности или специфической биологической активности биомедицинских клеточных препаратов стволовых/прогениторных клеток используют так называемые аналогичные клеточные препараты, полученные на основе аналогичных типов клеток у животных. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка методов выделения, культивирования и оценки свойств стволовых/ прогениторных клеток животных. ЦЕЛЬ. Разработать способ выделения прогениторных клеток сердца (ПКС) и оценка их васкулогенных свойств in vivo. Разработанный способ выделения основан на ретроградной перфузии изолированного сердца мыши по методу Лангендорфа. За счет создания избыточного давления в аорте перфузионный раствор (раствор Кребса-Хензеляйта и коллагеназа II) попадает в коронарные артерии. Проходя через коронарные сосуды, перфузионный раствор вызывает деструкцию межклеточного матрикса и приводит к межклеточному «разобщению» c образованием суспензии клеток. Полученная клеточная суспензия после градиентного центрифугирования использовалась для иммуномагнитной селекции с антителами к маркеру CD117 (с-kit). ПКС мыши имели сходный фенотип с прогениторными клетками сердца человека и характеризовались отсутствием маркеров гематопоэтических клеток, экспрессией маркеров стволовых клеток (с-kit, sca-1) и, частично, урокиназного рецептора, CD90, CD73, Notch 1. Полученные клетки мыши были способны к клонообразованию, образованию сфероидов и мультипотентной дифференцировке in vitro в кардиомиоцитарном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях, что сопоставимо с характеристиками ПКС человека. Для оценки in vivo ангиогенных свойств получаемых клеток мыши была использована модель подкожной имплантации клеток в Матригеле (MatrigelTM) экспериментальным мышам. Показано, что ПКС в со ставе Матригеля эффективно стимулируют его васкуляризацию, но только часть ПКС интегрировалась и дифференцировалась в клетки новообразованных сосудов, что указывает и на паракринные механизмы их ангиогенного действия. Разработанный нами способ выделения с-kit ПКС из миокарда грызунов позволяет получать клетки, которые обладают основными характеристиками прогениторных клеток сердца, проявляют васкулогенные свойства in vitro и in vivo. Получаемые ПКС аналогичны по своим свойствам с-kit ПКС из миокарда или ушка правого предсердия человека, и могут быть использованы при доклинической оценке эффективности биомедицинских клеточных продуктов на основе ПКС человека как аналогичный клеточный препарат.