Napravlennoe vnesenie deletsiy v genom fibroblastov krysy dlya izucheniya funktsiy mikrornk v protsesse pereprogrammirovaniya k plyuripotentnomu sostoyaniyu

Abstract

Full Text

МикроРНК (миРНК) - это малые некодирующие РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов во всех типах клеток. Основная функция миРНК - посттранскрипционная регуляция экспрессии генов. Неоднократные исследования доказывают, что некоторые миРНК участвуют в поддержании плюрипотентности и в перепрограммировании клеток к плюрипотентному состоянию. Поиск новых факторов, участвующих в перепрограммировании клеток к плюрипотентному состоянию, является неотъемлемой частью фундаментальных исследований. В настоящее время эффективность получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) составляет не более 1% от исходной популяции соматических клеток. Открытие и применение новых факторов позволит более тонко регулировать процесс перепрограммирования клеток к плюрипотентному состоянию и эффективнее получать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Лабораторная крыса одна из самых используемых животных моделей в экспериментальной медицине. Получение плюрипотентных клеток крысы дает новые возможности выведения трансгенных линий крыс и использование их в медицинских, токсикологических и фармакологических исследованиях. К тому же, в связи с развитием трансляционной медицины, потребность в изучении ИПСК данного модельного животного возрастает. Изучение ИПСК крысы позволит более эффективно проводить исследования, связанные с применением ИПСК в лечении некоторых заболеваний. Данная работа посвящена получению делеций локусов, содержащих сгруппированные гены миРНК, расположенные на Х-хромосоме лабораторной крысы. Ранее нами было установлено, что миРНК: miR-743a, miR-743b, miR-742, miR-883, miR-471, miR-3551, miR-741, miR-463, miR-880, miR-878, miR-881, miR-871, miR-3580, miR-465 - активно транскрибируются в плюрипотентных клетках, но их экспрессия в фибробластах отсутствует. Для выяснения роли данных миРНК в процессе перепрограммирования к плюрипотентному состоянию мы провели нокаут этих миРНК в фибробластах крысы. Для получения нокаута мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из двух направляющих РНК и позволяющую вносить протяженные делеции в геном. В настоящем исследовании мы получили линии клеток с делециями пяти участков, длиной от 3 т.п.н. до 45 т.п.н., в которых закодированы сгруппированные гены исследуемых миРНК. В дальнейшем планируется провести перепрограммирование полученных линий клеток для изучения влияния исследуемых миРНК на процесс перепрограммирования. Полученные результаты позволят расширить знания в области плюрипотентных стволовых клеток и участии миРНК в регуляции данного явления.