Sravnitel'noe issledovanie angiogennogo potentsiala sferoidov mmsk pk i skzht v fibrinovom gele

Abstract

Full Text

АКТУАЛЬНОЙ ПРОБЛЕМОЙ регенеративной медицины остается быстрое восстановление кровеносной системы при повреждении тканей и органов, а также создание de novo эффективной системы микроваскуляризации, обеспечивающей кровоснабжение биоэквивалентов. Одним из перспективных подходов к решению данного вопроса может стать использование трехмерных культур (сфероидов) аутологичных клеток в сочетании с биопечатью. В качестве источников аутологичных эндотелиальных предшественников и мультипотентных стромальных клеток для получения полноценного капиллярного русла могут быть использованы: Вартонов студень пупочного канатика и подкожная жировая ткань человека. ЦЕЛЬЮ данного исследования было проведение анализа ангиогенного потенциала индуцированных сфероидов, образованных мультипотентными мезенхимными стромальными клетками пупочного канатика (ММСК ПК) и стромальными клетками жировой ткани (СКЖТ). Сфероиды из ММСК ПК и СКЖТ человека получали в стандартных условиях (37°С; 5% СО2) 3D культивирования в течение 7сут. на агарозных микропланшетах, приготовленных с помощью форм 3DPetriDishes (Microtissue, USA). Эндотелиальную дифференцировку индуцировали добавлением фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Через 7 сут. часть сфероидов фиксировали для анализа синтеза CD31,Flk-1 и виментина. Часть сфероидов помещали в немодифицированный и модифицированный фибриновые гели, приготовленные с помощью добавления тромбина к фибриногену в соотношении 0,2 U на 1 мг. Модифицировали фибриноген путем добавления к нему О,О'-бис[2-(N-сукцинимидил-сукциниламино)этил]поли(этиленгликоль) в молярном соотношении 5 к 1. Фоторегистрацию осуществляли в приборе для прижизненной цейтраферной микроскопии (ChipManTechnologies, Finland). После индукции дифференцировки сфероиды как из ММСК ПК, так и из СКЖТ кроме виментин+ клеток содержа ли субпопуляцию CD31+/Flk-1+ клеток. Через 24 ч. после помещения сфероидов ММСК ПК и СКЖТ в гель, наблюдали активную клеточную миграцию в виде тяжей в обоих типах геля. Через 7 сут. CD31 + клетки обеих культур формировали разветвленную сеть тубулоподобных структур, соединяющую отдельные сфероиды. Мезенхимные виментин+ клетки мигрировали разрозненно и прикреплялись к тубулоподобным структурам. В отличие от модифицированного геля, сфероиды ММСК ПК и СКЖТ в течение 3 сут. активно резорбировали немодифицированный фибриновый гель и оседали на поверхность культурального пластика, формируя монослой. При анализе данных, полученных при фоторегистрации, было также установлено, что модифицированный фибриновый гель способствовал образованию большего числа ветвлений в новообразованной сети. Таким образом, было показано, что 3D культивирование ММСК ПК и СКЖТ в индукционной среде обеспечивает эндотелиальную дифференцировку части клеток культуры, подтвержденную синтезом маркеров эндотелиальных клеток (CD31, Flk-1) и способностью к формированию сети тубулоподобных структур in vitro. Клетки сфероидов, в отличие от суспензии клеток, в течение 7 сут. создают упорядоченную сеть, представленную как эндотелиальными, так и мезенхимными компонентами. При этом было выявлено, что модифицированный фибриновый гель является более стабильным субстратом, чем немодифицированный гель, и обеспечивает формирование более разветвленной капилляроподобной сети. Полученные данные имеют фундаментальное и прикладное значение для разработки технологий получения микроциркуляторного русла с помощью сфероидов из аутологичных клеток пациента.