ROL' KLETOK SERTOLI V KUL'TIVIROVANII SPERMATOGONIY KhRYaKA V METILTsELLYuLOZE

Abstract

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ. В последнее время появляются сообщения о новом подходе для возможного получения спермиев - трехмерном культивировании, наиболее близко имитирующем микроокружение семенного эпителия. Создание данной системы позволит расширить понимание о взаимодействии между клетками Сертоли и ранними мужскими половыми клетками, между половыми клетками и внеклеточным матриксом, а также позволит определить влияние этих взаимодействий на процесс сперматогенеза. ЦЕЛЬ. Оценить влияние клеток Сертоли на сперматогонии хряка при культивировании их в метилцеллюлозе. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. В качестве объекта использовали сперматогонии, выделенные из тестикул неполовозрелых помесных 40-сут. хряков. Очистку сперматогоний от других клеточных типов проводили, используя центрифугирование в ступенчатом градиенте перколла с последующим разделением по адгезии. Трехмерный матрикс представлял собой структуру, состоящую из верхнего (мягкого) и нижнего (твердого) слоев, представленных 2,5% и 5% растворами метилцеллюлозы соответственно. Культивирование осуществлялось по схеме «простой сэндвич». Были сформированы две экспериментальные группы. В первой группе верхний слой матрикса был представлен сперматогониями, во второй - смесью сперматогоний и клеток Сертоли. Морфологическую оценку проводили как в нативных препаратах, так и в окрашенных по Гимза мазках. Уровень пролиферации определяли по приросту клеток, а жизнеспособность по окраске 0,1% раствором трипановой сини. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В результате анализа полученных данных установлено, что сперматогониии хряка в обеих экспериментальных группах оставались жизнеспособными вплоть до 21 сут. Гистологический анализ показал равномерное Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 60 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине распределение клеток по верхнему слою матрицы в обеих группах. Морфологический анализ мазков выявил дифференцировку сперматогоний во 2-й группе. На 7 сут. сокультивирования сперматогоний и клеток Сертоли в метилцеллюлозе происходило объединение клеток в группы, формирование цепочек и тяжей, а на 21 сут. формирование структур, подобных семенным канальцам in vivo. Клеточный состав образованных на 21 сут. семенных канальцев характеризовался гетерогенностью и был представлен сперматогониями (5%), сперматоцитами 1-го и 2-го порядка (17%), округлыми сперматидами (33%), удлиненными сперматидами (6%) и клетками Сертоли (39%). Клеточная популяция первой экспериментальной группы характеризовалась гомогенностью и отсутствием дифференцировки на 21 сут. трехмерного культивирования. Оценка пролиферации выявила увеличение численности сперматогоний в первой группе в 2,5 раза. Таким образом, совместное культивирование сперматогоний хряка и клеток Сертоли в 2,5% растворе метилцеллюлозы, способствует дифференцировке сперматогоний до стадии удлиненных сперматид на 21 сут и формированию семенных канальцев in vitro.