MUL'TIPOTENTNYE MEZENKhIMAL'NYE STROMAL'NYE KLETKI ENDOMETRIYa: IZOLYaTsIYa, EKSPANSIYa IN VITRO I MORFOFUNKTsIONAL'NYE SVOYSTVA

Full Text

Эндометрий обладает значительной способностью к регенерации, которая базируется на существовании нескольких типов стволовых/прогениторных клеток: эпителиальных, эндотелиальных и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (эММСК). эММСК являются перспективным клеточным типом для использования в регенеративной медицине. ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Получить из минимальной биопсии культуру эММСК, размножить до клинически значимого количества и исследовать их морфофункциональные свойства. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Все процедуры были выполнены с добровольного письменного информиро ванного согласия пациентов. Образцы эндометрия (n = 10) были получены при помощи биопсии в ходе диагностической гистероскопии в первую фазу менструального цикла. Фрагменты ткани были диссоциированы при помощи ферментативной обработки раствором с 0,05% коллагеназы IA и 0.05% проназы в течение 1 ч. при 370. Клетки были культивированы в ростовой среде следующего состава: базальная среда DMEM:F12, 10% ЭТС, 1 нг/мл FGF-2, 2 мМ стабильного глутамина, 1% раствора анти-биотиков/антимикотика в мультигазовом инкубаторе при 5% СО2 и 5% О2. Для определения фенотипа, клоногенного потенциала (КОЕф тест), способности к направленной адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференциации, продукции факторов ро-ста/цитокинов при помощи мультиплексного анализа BioPlexPro (Bio-Rad) использовали клетки 3-го пассажа (П). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В первичной культуре популяция эндометриальных клеток была морфологически гетерогенной и состояла из клеток с фибробластоидной и эпителоидной морфологией. На 3-м пассаже при экспансии по нашему протоколу культура клеток состояла преимущественно из клеток с фибробласто-подобной морфологией. Клетки обладали характерным для ММСК фенотипом: CD73 + CD90 + CD105 + CD34-CD45-HLA-DR-. Также была детектирована позитивная экспрессия следующих маркеров: CD146 + CD166 + CD49f+CD140a + CD140b + Nestin + . Среднее время удвоения клеточной популяции при экспансии до П3 составляло 29,6±1,3 ч. эММСК были способны к направленной адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференциации. Средняя частота КОЕф в культуре П3 равнялась 35,7±3,4%. эММСК показывали способность к спонтанному формированию 3D сфероидов. Стабильность кариотипа эММСК при долговременном культивировании (до П8) была подтверждена GTG-окраской. После 48 ч. инкубации в бессывороточных условиях эММСК секретировали следующие факторы роста и цитокины: IL-1ra (74,6±9,5 пг/мл), IL-6 (29,8±8,3 пг/мл), (138,5±33,3 пг/мл), IFNγ (55,9±3,8 пг/мл), VEGF (92,2±19,8 пг/мл), GM-CSF (133,2±5,1 пг/мл), FGF-2 (17,8±4,3 пг/мл), хемо-кины IP-10 (39,9±3,3 пг/мл) и MCP-1 (41,1±6,7 пг/ мл). Таким образом эММСК могут быть эффективно размножены из минимальной биопсии с сохранением высокого клоногенного и пролиферативного потенциала, нормального кариотипа и специфического фенотипа. По морфофункциональным свойствам эММСК удовлетворяют минимальным критериям ISCT для ММСК и перспективны для разработки клеточной терапии репродуктивной дисфункции эндометрия.

About the authors

N. M Todosenko

A. V Zlatskaya

L. S Litvinova

A. E Rodnichenko

O. S Gubar'

V. V Shupletsova

I. M Gordienko

D. A Zubov

R. G Vasil'ev

Email: rvasyliev.ilaya@gmail.com

References

Supplementary files