Ispol'zovanie sistemy CRISPR/CAS9 dlya izucheniya kletochnoy modeli spinal'noy myshechnoy atrofii

Full Text

Крайне актуальной на сегодняшний день задачей является разработка новых способов терапии спинальной мышечной атрофии (СМА), поскольку Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине 55 существующие методы обеспечивают лишь временное поддержание жизни пациентов. Поскольку данное заболевание является наследственным и обусловлено известной мутацией в гене SMN1, то перспективным подходом является генная терапия. В последние годы появился новейший инструмент -система CRISPR/Cas9, с помощью которой можно редактировать геном плюрипотентных и дифференцированных клеток пациента с наследственным заболеванием таким образом, чтобы исправить имеющуюся мутацию. Кроме того в настоящее время активно развивается направление, основанное на получении клеточных моделей СМА с помощью дифференцированных производных пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека. Моторные нейроны, дифференцированные из ИПСК и воспроизводящие фенотип данного заболевания, могут быть использованы в исследованиях патогенетических механизмов, приводящих к избирательной гибели двигательных нейронов, для скрининга лекарственных препаратов и разработки тактики лечения СМА. В данной работе была получена и охарактеризована новая модельная система СМА, состоящая из пациент-специфичных клеток больных СМА I, II типа и здорового человека. Изучен и оценен статус плюрипотентности клеточных линий, полученных в результате репрограммирования фибробластов, в системе in vitro. Доказано, что полученные культуры являются плюрипотентными стволовыми клетками и имеют соответствующую морфологию, характерный профиль экспрессии генов, участвующих в поддержании самообновления и плюрипотентности, а также несут признаки генетических аберраций, связываемых с развитием спинальной мышечной атрофии. Доказано, что спектр дифференцированных производных, полученных в результате спонтанной дифференцировки индуцированных клеточных линий, представлен производными трех зародышевых листков - экто-, эндо- и мезодермы. Проведена направленная дифференцировка полученных культур в моторные нейроны. Показана экспрессия основных маркеров данного типа клеток: SOX1, PAX6, OLIG2, SYNI, HB9, ISL1, NF200, TUJ1, MAP2, CHAT. Показано, что нейроны, полученные от пациента со СМА II типа, обладают более выраженной спонтанной активностью и более деполяризованы в покое, чем нейроны контрольной линии. Клеточная модельная система СМА, полученная в данной работе, является удобным объектом для тестирования и оценки эффектов использования CRISPR/Cas9-опосрeдованной коррекции мутации в гене SMN2. В ходе дифференцировки ИПСК проходят несколько стадий от нейроэпителиальных предшественников до зрелых двигательных нейронов, которые воспроизводят основные стадии развития данного типа нервных клеток в онтогенезе человека. Таким образом, можно моделировать и оценивать эффекты коррекции мутаций в разных типах клеток, то есть на разных стадиях развития заболевания.

About the authors

K. R Valetdinova

Email: kamila23@list.ru

V. S Ovechkina

E. V Grigor'eva

M. A Maretina

A. V Kiselev

V. S Baranov

S. P Medvedev

S. M Zakiyan

References

Supplementary files