N-atsildofaminy - regulyatory protsessov proliferatsii i differentsirovki

Abstract

Full Text

N-Ацилдофамины (NADA)- конъюгаты дофамина и жирных кислот, чаще всего ненасыщенных. Эти вещества относятся к семействам эндоканнабиноидов и эндованилоидов. Они образуются в организме как млекопитающих, так и более примитивных организмов и участвуют во многих процессах регуляции в организме и клетке. К известным мишеням NADA относятся GPCRCB1, CB2, нe-CB1/CB2, ионный канал TRPV1 а также ряд других белков (дофаминовый рецептор, кальциевые и калиевые каналы). Участие NADA в процессах регенерации тканей практически не изучено. Цель данной работы - изучение действия NADA и их производных на пролиферацию и дифференцировку клеток в условиях долговременной обработки, а также выяснение соответствующих механизмов. Поскольку большая часть известных эффектов NADA реализуется в рамках нервной системы, мы использовали в качестве модели линии клеток феохромоцитомы PC12, глиомы C6 и ней-робластомы HT-22. Для каждой линии для набора NADA были определены LC50, после чего культуры инкубировали с разными концентрациями веществ две недели. Гибель клеток и её характер обнаруживали с помощью MTT и LDH тестов, по активности каспаз и окрашиванию аннексином. Степень дифференцировки определяли по длине и числу отростков и по экспрессии мРНК ряда маркеров стволовых клеток, астроцитов, зрелых нейронов и их предшественников. Молекулярные мишени NADA и пути передачи сигнала внутри клетки определяли с помощью селективных ингибиторов, репортерных систем и нокдауна миРНК. Для NADA с остатками арахидоновой, олеиновой и докозагексаеновой кислот, а также амидов арахидоновой кислоты с тирамином и норадреналином в диапазоне 2-30 мкМ наблюдали 50% гибель клеток, а увеличение времени инкубации не приводило к возрастанию числа погибших клеток. Напротив, вещества в концентрации ниже 1 мкМ стимулировали пролиферацию, а в диапазоне от 1 мкМ до LC50 индуцировали рост отростков и сдвиг в сторону экспрессии нейрональных маркеров у PC12 и астроцитарных у C6. Для клеток HT-22 была зафиксирована только гибель. Молекулярной мишенью NADA на клетках PC12 был рецептор GPR55, который передавал сигнал через PLC, IP3R и кальций на CaMKIV и затем на фактор транскрипции CREB, который запускал экспрессию NO синтазы и, предположительно, секрецию IL-6; предполагается, что IL-6 обеспечивает запуск дифференцировки через путь JAK/STAT. Таким образом, на модели крысиных глиомы C6 и феохромоцитомы PC12 нам впервые удалось показать, что низкие концентрации N-ацилдофаминов (до 1 мкМ) стимулируют пролиферацию, промежуточные (1-20 мкМ) индуцируют дифференцировку, а более высокие ведут к апоптозу, опосредованному активацией специфического рецептора. Не исключено, что NADA могут быть одним из важных факторов в регенерации тканей после повреждений. Работа частично поддержана грантом РФФИ 16-04-00729а.