RGD-zavisimaya agregatsiya normal'nykh kletok kak novyy podkhod dlya tkanevoy inzhenerii

Abstract

Full Text

Поддержание высокой выживаемости трансплантируемых клеток, а также обеспечение их правильного фенотипа и дифференцировки является одной из важных задач тканевой инженерии. Ранее было показано, что культивирование нормальных клеток в мультиклеточных сфероидах способствует выживаемости клеток и сохранению их фенотипа. По сравнению с монослойными культурами, клетки в сфероидах также имеют повышенный регенеративный потенциал (Cesarzetal, 2016). При этом сфероиды можно рассматривать как строительные блоки для восстановления ткани, которые можно имплантировать как отдельно, так и в составе биодеградируемого полимерного матрикса. К настоящему времени разработано несколько способов формирования сфероидов, но все они обладают недостатками, в частности, трудоемкостью и малым количеством получаемых сфероидов. Ранее нами был разработан новый метод формирования сфероидов из опухолевых клеток с использованием циклических RGD-пептидов (Akasovetal, 2016). Целью настоящего исследования являлась разработка простого и универсального RGD-зависимого способа получения сфероидов из первичных культур нормальных клеток. Для работы в качестве модельных клеток использовали фибробласты, выделенные из кожи человека и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из жировой ткани. Клетки помещали в 96-луночный планшет (10,000 клеток на лунку) и добавляли циклический RGD-пептид непосредственно к монослойной культуре клеток в концентрации 1-100 мкМ. Было показано, что через 48-72 ч. клетки агрегировали с образованием сфероидов при концентрации пептида в интервалах 10-100 мкМ и 25-100 мкМ, соответственно. Меньшая концентрация, необходимая для формирования сфероидов из МСК, может свидетельствовать о различиях в уровнях экспрессии интегринов и/или гликозилирования, как это было показано нами ранее (Haqetal, 2017). При этом средние размеры полученных сфероидов были 56±13 мкм для МСК и 50±10 мкм для фибробластов. Высокая выживаемость клеток в сфероидах была подтверждена флуоресцентным тестом «живой-мертвый». Интересно, что удаление пептида из среды приводило к адгезии клеток к поверхности планшета в течение 24 ч. Также сфероиды включали в коллагеновый гель (95% коллагена I), имитирующий условия in vivo. При этом было обнаружено, что сфероиды в отсутствие RGD-пептида распадались на отдельные клетки, которые заселяли гель в течение 3-5 дней. Таким образом, был разработан новый метод получения сфероидов из нормальных клеток с помощью RGD-агрегации и показана обратимость процесса. Разработанные подходы можно использовать в качестве новой стратегии в тканевой инженерии, в том числе для заселения полимерных биодеградируемых матриксов.