Aspects for generation of transgenic mammals in the USSR: little-known details of an initial step

Abstract

This paper provides well-known as well as little-known data for initial steps of the development of transgenic mammals in the USSR, namely for the collaboration of the Department of Embryology (professor A.P. Dyban) of the Research Institute of Experimental Medicine of the Academy of Medical Sciences, USSR (Leningrad) and the Laboratory of Cellular Engineering (PhD. S.I. Gorodetsky) of the Institute of General Genetics of the Academy of Sciences, USSR (Moscow), and some details about the life journey of these research unit leaders.

Full Text

История разработки генетической трансформации на уровне отдельных клеток, а также создания трансгенных животных подробно описана в многочисленных публикациях, однако следует отметить, что первая работа об успешной генетической трансформации млекопитающих (мышей) посредством метода микроинъекции рекомбинантных плазмид с клонированным геном в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки была опубликована зарубежными исследователями в 1980 году. За последующие три года (1981-1983) были опубликованы данные о рождении трансгенных мышей полученных посредством микроинъекций в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток различных клонированных генов: тимидинкиназы вируса herpes simplex, ß-глобина человека и кролика, лейкоцитарного интерферона человека, трансферрина курицы, гормона роста крысы и человека [1]. Ничуть не умаляя заслуг отечественных ученых, внесших большой вклад в создание не только трансгенных лабораторных млекопитающих, но и сельскохозяйственных животных, в настоящей статье пойдет речь о первопроходцах и их пионерских исследованиях, то есть о коллективах доктора медицинских наук, профессора Андрея Павловича Дыбана (Отдел эмбриологии Института экспериментальной медицины АМН СССР, Ленинград) и кандидата медицинских наук Станислава Ивановича Городецкого (Лаборатория генной инженерии Института общей генетики АН СССР, Москва). Энциклопедичность знаний не только в своей профессиональной области, уникальные аналитические способности позволяли выдающемуся ученому - эмбриологу, специалисту в области биологии развития, профессору А.П. Дыбану (1922-2013), не утонуть в море литературных данных, а трезво оценивать, сравнивать, синтезировать и вследствие этого не только выявлять современные перспективные пути развития науки, но и, обогащая их, направлять действия коллектива на передовые рубежи мировой науки. Особенностью научного творчества А.П. Дыбана являлось то, что он не замыкался в рамках только одного научного направления, а, обладая энциклопедическими знаниями не только в области экспериментальной эмбриологии и научным предвидением, успешно развивал и вносил существенный вклад в новые научные области - экспериментальную тератологию, цитогенетику развития млекопитающих, генетику поведения, трансгеноз млекопитающих [2]. рис. 1. Профессор Андрей Павлович Дыбан, 1992 г. К моменту первой зарубежной публикации об успешной генетической трансформации зародышей млекопитающих Отдел эмбриологии НИИЭМ АМН СССР уже на протяжении 15 лет являлся общепризнанным Всесоюзным центром в области экспериментальной эмбриологии, тератологии, цитогенетики раннего развития лабораторных млекопитающих. Сотрудники Отдела и их руководитель не только проводили современные исследования действительно мирового уровня, но и обучали прикомандированных из других институтов, как теоретическим основам раннего развития, так и практическим навыкам работы на зародышах млекопитающих, в том числе и культивированию in vitro доимплантацион-ных и постимплантационных эмбрионов мышей и крыс. Большим достижением профессора А.П. Дыбана было создание уникального коллектива исследователей, причем каждый из его сотрудников стал известным высококлассным специалистом, занимая конкретную нишу в области экспериментальной эмбриологии лабораторных млекопитающих. В связи с чем, одной из причин, обусловившей преимущество в получении пионерских результатов Отделом эмбриологии НИИЭМ АМН СССР в области создания трансгенных млекопитающих, являлся уникальный коллектив, которому в отличие от других подразделений страны, не нужно было приобретать «с нуля» или совершенствовать навыки работы с зародышами мышевидных грызунов. В начале 80-х годов С.И. Городецкий (Институт общей генетики АН СССР, Москва), яркий представитель отечественной генной инженерии, понимая, что биотехнологии млекопитающих принадлежит будущее, предпринял «путешествия» по академическим коридорам власти с целью выяснить, кто в СССР способен создать трансгенных млекопитающих. Сотрудники аппарата сообщили, что если кто и сможет реализовать эту задачу, то это профессор А.П. Дыбан из Ленинграда - руководитель Отдела эмбриологии НИИ экспериментальной медицины АМН СССР, головного научного центра по экспериментальной эмбриологии млекопитающих. Так возникло плодотворное научное сотрудничество С.И. Городецкого и А.П. Дыбана, с годами перешедшее в доверительные отношения и дружбу. Это и немудрено, ведь яркость личности С.И. Городецкого привлекала к нему творческих людей (певицу Г. Образцову, композитора В. Гладилина, писателя В. Войновича и др.). Имя Станислава Ивановича Городецкого (а также А.С. Каледина и А.Г. Слюсаренко) останется в истории науки в связи с описанием термостабильной ДНК-полимеразы [3], которая в настоящее время используется во всем мире в цепных полимеразных реакциях для молекулярно-генетических исследований и диагностики заболеваний. Однако, патент на это открытие был выдан одной из зарубежных фирм - то есть и не нашим ученым и не группе американских биохимиков, которые ранее также описали ДНК полимеразу; а Нобелевская премия (1993) за метод ПЦР, как известно, была присуждена К. Мулису и М. Смиту. На вопрос о том, почему не была запатентована термостабильная ДНК-полимераза и ее свойства, С.И. Городецкий отвечал, что он не сделал это сознательно, ибо открытие это должно принадлежать не кому-либо, а всему мировому научному сообществу. Об отсутствии у С.И. Городецкого стандартной реакции на реальную действительность можно также судить не только не только по тому, что он не стремился защитить докторскую диссертацию, которой он был давно достоин благодаря своим научным достижениям. О принципиальности С.И. Городецкого свидетельствует и факт отказа (в начале 2000-х годов) от значительного контракта на работу в одной из зарубежных стран по созданию трансгенных млекопитающих. Накануне подписания договора С.И. Городецкий выявил невозможность выполнения задания, причем не в той части, за которую Рис. 2. Станислав Иванович Городецкий, 2001 отвечал, а на следующем этапе работы исследователей в связи с появившимися новыми сведениями об особенностях работы одного из белков у данного вида животных. Таким образом, в начале 1980 годов в нашей стране был сформирован не закрепленный юридически межведомственный коллектив единомышленников, идейно возглавляемый профессором А.П. Дыбаном, представленный сотрудниками Отдела эмбриологии Института экспериментальной медицины АМН СССР (Ленинград) и лаборатории генной инженерии Института общей генетики АН СССР (Москва). К этому времени сотрудники Отдела эмбриологии ИЭМ имели не только многолетний опыт работы по манипуляциям с зародышами: их трансплантацией, культивированием in vitro, но и навыками микроинъекций в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Коллектив же лаборатории, возглавляемой С.И. Городецким, в совместных исследованиях выполнял чрезвычайно важную генно-инженерную часть работы: создавал конструкции с выбором эффективных промоторов, клонировал рекомбинантные молекулы ДНК, выявлял наличие чужеродных генов в клетках родившихся животных и т. п. В 1983 году ученые опубликовали первые совместные результаты об успешной интеграции в геном мышей клонированных генов тимидинкиназы вируса герпеса и SV40 и высоком проценте родившихся трансгенных животных [1, 4-8]. Дальнейший прорыв в исследованиях, получивший большой резонанс, наступил в результате продолжения совместной работы - впервые в стране были созданы трансгенные мыши (1984) [1, 7, 9, 10] и впервые в мире - трансгенные крысы (1986) [11 1 3] с интегрированным геном гормона роста человека. Дело в том, что признание научных заслуг профессора А.П. Дыбана мировым сообществом эмбриологов, те-ратологов, цитогенетиков раннего развития млекопитающих и его личные контакты способствовали созданию безупречной репутации и доверительных отношений Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ИСТОРИЯ 11 среди элиты зарубежных исследователей. Эти обстоятельства и позволили Андрею Павловичу обратиться с просьбой и на безвозмездной основе получить от известного ученого профессора Р. Пальмитера (R. Palmiter) (еще до публикации одной из его статей по данной тематике) в личное распоряжение плазмиды с геном гормона роста человека. На созданных таким образом трансгенных мышах и крысах изучали влияние чужеродных генов на различные процессы в пре- и постнатальном онтогенезе [1, 8, 10-12], распределение клонированной и интродуцированной ДНК в ранних зародышах [14]. Были получены пионерские данные, свидетельствующие не только о стимуляции, но и торможении роста и возникновении карликовости у трансгенных мышей [1, 4, 10-12]. У трансгенных крыс были выявлены особенности работы генов гормона роста человека в разные периоды постнатального онтогенеза. Используя интродукцию клонированных генов, изучали особенности организации и функции генома в начальном эмбриогенезе млекопитающих. При интеграции чужеродных клонированных генов млекопитающих в зиготу мышей не во всех случаях происходила экспрессия генов, что, как было показано, зависело от многих причин, а не только от наличия сильных промоторов и энхансеров [1, 15]. А.П. Дыбан сформулировал гипотезу о том, что во время первого раунда репликации ДНК происходит репрограммирование хроматина пронуклеусов и создается такая структурно-функциональная организация ядра, при которой одни гены доступны для стадиоспецифической и органоспецифической регуляции, а другие на ранних стадиях развития экспрессируются вне этих регуляторных систем, обеспечивая общие метаболические потребности клеток [16, 17]. Таким образом, исследования на трансгенных мышах и крысах были сосредоточены на изучении механизмов индивидуального развития млекопитающих [17, 18], хотя и отдавалось должное возможности получения животных-продуцентов биологически активных веществ с помощью метода микроинъекций клонированных генов в оплодотворенные яйцеклетки и достижений генной инженерии млекопитающих для разработки методов генной терапии [13, 19]. В рамках второй группы исследований в Отделе проводили, в частности, и генетический анализ нескольких поколений животных, полученных от трансгенных мышей. На объединенном заседании Президиума АН СССР (1984) профессор А.П. Дыбан выступил с программным докладом об успехах в создании трансгенных животных в СССР, которое проводилось не только с целью перспектив познания механизмов раннего развития млекопитающих, но и получения биопродуцентов, в частности, лекарственных и биологически активных веществ. Вице-президент АН СССР, академик АН СССР Юрий Александрович Овчинников публично, в присутствии всех, в том числе и руководства НИИ экспериментальной медицины АМН СССР поддержал развитие этих исследований и добавил, что «...профессора в обиду мы не дадим». Дело в том, что на Ученом Совете Института экспериментальной медицины (1983) Андрей Павлович сделал Отчетный доклад с демонстрацией полученных коллективом данных о трансгенных млекопитающих и перспективами дальнейшего развития исследований, который был высоко оценен и поддержан, в частности, известным ученым членом-корреспондентом АМН СССР С.А. Нейфахом (зав. лабораторией биохимической генетики того же института). Однако у тогдашнего директора, мягко говоря, не только не было понимания важности данного направления исследований, но и были свои соображения о судьбе Отдела и его руководителя. Однако после выступления на заседании Президиума АН СССР (1984) Отдел эмбриологии не только получил от Академии целевым назначением определенное финансирование, но и карт-бланш на продолжение исследований по данной тематике. Работы коллективов А.П. Дыбана и С.И. Городецкого по созданию и изучению трансгенных млекопитающих были признаны пионерскими не только всем научным сообществом страны, но и официальными лицами. Так, например, результаты их исследований и дальнейшие перспективы этого направления в качестве примера достижений отечественной науки на мировом уровне прозвучали в докладе вице-президента ВАСХНИл директора Института общей генетики академика А.А. Созинова на XXVII съезде КПСС (1986). Неоценимая роль в получении первых трансгенных млекопитающих принадлежала ученикам Андрея Павловича: кандидатам наук Б.Л. Вайсману, Г.Ф. Голинскому, Г.Г. Секириной, И.Б. Архангельской, Л.И. Хожай, а впоследствии и Т.В. Игнатьевой, А.В. Сорокину, О.В. Кидготко и другим исследователям. В частности, Борис Львович Вайсман и Георгий Фаддеевич Голинский, имея в своем распоряжении довольно скромное оборудование, проявляя «кулибинскую» смекалку совершенствовали технику, необходимую для трансплантации генетического материала в мужской пронуклеус, были не только первыми сотрудниками Отдела, которые выполняли микроинъекции, но и ведущими исполнителями и соавторами всех пионерских исследований коллектива. Г.Г. Секирина, И.Б. Архангельская, Л.И. Хожай и другие исследователи отвечали за чрезвычайно важный участок эмбриологической части работы - работу с зародышами и самками-реципиентами, которым трансплантировали зародыши с интегрированными генами. Велика роль Т.В. Игнатьевой, принимавшей участие в создании трансгенных крыс с интегрированнм геном гормона роста человека и защитившей впоследствии кандидатскую диссертацию по изучению действия гена гормона роста человека на онтогенез крыс. Коллектив С.И. Городецкого и его единомышленники (А.С. Каледин, Т.В. Капелинская, Г.А. Попкова и др.) не только размножили плазмиды на основе промотора гена металлотионеина 1 мыши с геном гормона роста человека, любезно предоставленные Р. Пальмитером, но и конструировали новые, подходящие для решения поставленных теоретических и прикладных задач, в том числе и тканеспецифичные векторы. С.И. Городецким лично и его сотрудниками были созданы плазмиды на основе иных промоторов, в частности, гена тирозинамино-трансферазы крысы с геном гормона роста человека; фрагмента генома вируса бычьей папилломы с геном гормона роста человека; гена металлотинеина 1 мыши с кДНК гормона роста человека и сигналом терминации транскрипции природного гена гормона роста человека; под контролем регуляторных элементов генов белка казеина, а также интерлейкина-13 человека (В.А. Торопова и В.Г. Коробко - ИБХ РАН) и другие конструкции, необходимые для создания трансгенных млекопитающих. Несомненным достижением коллективов А.П. Дыбана и С.И. Городецкого являлось использование трансгенных моделей для исследования особенностей организации и функции генома в начальном эмбриогенезе млекопитающих. Действительно, впервые в мире были получены крысы с интегрированным геном гормона роста человека, впервые в стране мыши с интегрированным геном гормона роста человека, а в дальнейшем в содружестве с другими исследователями трансгенные мыши с интегрированным геном интерлейкина-13 человека Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 12 ИСТОРИЯ (совместно с В.А. Тороповой и В.Г. Коробко); были созданы модели для изучения: сахарного диабета [20], а в содружестве с Отделом биохимии НИИЭМ АМН СССР и атеросклероза [21]. Официальное признание вицепрезидентом АН СССР академиком Ю.А. Овчинниковым и Президиумом АН СССР указанных работ коллективов двух крупных отечественных ученых и соответствующее постановление о чрезвычайной актуальности исследований по созданию трансгенных млекопитающих послужили сигналом для мощного всплеска исследований по этому направлению в СССР. Впоследствии, особенно после Постановления Совмина СССР (1985 год) «О дальнейшем развитии новых направлений биологии и биотехнологии», были созданы ведомственные, межведомственные, межреспубликанские, союзные, а в дальнейшем и межгосударственные Программы, что позволило получить другим коллективам, как работавшим в этом направлении, так и переключившимся на эту тематику, гигантское финансирование, в основном, на создание трансгенных сельхозживотных-биопродуцентов. В заключение необходимо отметить, что трансгенные млекопитающие сыграли свою роль не только для возможного использования их в качестве продуцентов биологически активных веществ и лекарственных препаратов, но и в качестве моделей тех или иных заболеваний, а также моделей для познания механики развития лабораторных млекопитающих. Были получены важные результаты, характеризующие развитие тех или иных систем в присутствии чужеродного гена и генопродукта. В дальнейшем же акцент исследований этого направления сместился в сторону другой модели, т. е. от трансгенных к нокаутным животным.