Effects of autologous gingiva-derived cells with myogenic potential on regeneration of skeletal muscle

Full Text

Ввєдєниє Поперечно-полосатая скелетная мышечная ткань (ППСМТ), масса которой составляет около половины всей массы тела, образует скелетные и внескелет-ные мышцы, обеспечивает выполнение движений - одну из основных функций живого организма, и играет важную роль в его жизнедеятельности и гомеостазе [1]. Поддержание скелетной мускулатуры в нормальном функциональном состоянии - обязательное условие обеспечения полноценного качества жизни человека. Скелетная мускулатура подвержена воздействию многих экзогенных факторов различной природы, влияние которых часто приводит к повреждению мышц. Кроме того, на гистогенез и гистофизиологию ППСМТ оказывают влияние дефекты в генах, приводящие к мышечным дистрофиям (например, мышечная дистрофия Дюшенна - Беккера, дисфер-линопатии, кальпаинопатии и т.д.). При серьезных повреждениях ткани имеющийся ортотопический камбиальный резерв (миосателлитоциты и иные клетки-предшественницы с миогенным дифферен-цировочным потенциалом), как правило, не обеспечивает гисто- и органотипической репарации мышечного органа, что обусловливает актуальность разработки новых методов индукции регенерации ППСМТ. Поиски путей восстановления структуры и функций поврежденных скелетных мышц идут по разным направлениям: с помощью фармакологических препаратов, клеточной терапии [2, 3], генной инженерии [2, 4, 5]. Одним из перспективных направлений является применение клеточных технологий, базирующихся на трансплантации клеток с миогенным потенциалом, то есть способных дифференцироваться в миотубы (мышечные трубочки), а в дальнейшем - в мышечные волокна [3, 6]. ППСМТ представляет собой сложную систему, состоящую из взаимодействующих многоядерных структур - мышечных волокон, являющихся ее структурно-функциональными единицами, и кле-ток-предшественниц - миосателлитоцитов. ППСМТ в составе мышечного органа находится в динамичном морфо-функциональном взаимодействии с нервным аппаратом. Мышечные волокна сгруппированы в пучки, совокупность которых формирует мышечный орган - скелетную мышцу [7]. Основной клеточной популяцией, ответственной за физиологическую и репаративную регенерацию ППСМТ, являются миосателлиоциты [8, 9]. Однако в исследованиях последних лет идентифицированы и другие популяции клеток (мышечного и немышечного происхождения), способные участвовать в рабдо-миогистогенезе. Подробно характеристики таких клеток и перспективы их возможного применения в клинической практике рассмотрены ранее в нескольких обзорах [10-12]. В наших предыдущих исследованиях впервые был описан миогенный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из альвеолярной (подвижной) десны [13, 14]. Выделенная субпопуляция ММСК характеризовалась высоким пролиферативным потенциалом (почти в два раза выше, чем у ММСК костного мозга). Миогенная индукция этих клеток в условиях in vitro приводила к образованию в культуре многоядерных вытянутых структур, экспрессировавших специфические маркеры (скелетный актин, скелетный миозин, MyoD1, миогенин). При этом эффективность миогенной дифференцировки, независимо от пассажа ММСК (вплоть до десятого), оставалась на высоком уровне [13]. Также были охарактеризованы секреторные профили и экспрессия генов миогенеза в ММСК десны, полученных из различных анатомических локализаций (альвеолярная и прикрепленная десна) [15, 16]. В результате было показано, что клетки альвеолярной десны активно секретируют промиогенные цитокины [15] и по транскриптомным профилям генома во многом совпадают с миосателлитоцитами [16]. Помимо этого, в недавних исследованиях была описана способность к спонтанной дифференцировке ММСК альвеолярной десны в миотубы in vitro [14]. Все это позволяет считать ММСК альвеолярной десны важным и перспективным видом клеток для лечения повреждений скелетных мышц. Целью настоящей работы была оценка влияния аутогенных ММСК десны на процессы регенерации ППСМТ после механического повреждения в эксперименте. В настоящее время в литературе описано большое число различных экспериментальных моделей повреждения мышц с использованием различных повреждающих агентов (механические, фармакологические, химические, генетические) [17]. Нами была выбрана модель с рассечением мышцы, или «рассечение-сшивание». Рассечение мышцы является одним из наиболее простых и воспроизводимых инвазивных видов повреждения мышечной ткани, который моделирует нарушение целостности органа, происходящее при бытовых, криминальных, техногенных, некоторых боевых травмах и хирургических вмешательствах. Материал и методы Дизайн исследования Исследование проводилось на кроликах-самцах (n = 11) породы советская Шиншилла, массой тела 2,5-3,0 кг, при соблюдении правил гуманного обращения с лабораторными животными. Каждому кролику перед основной частью эксперимента выполняли биопсию альвеолярной десны для получения аутогенных ММСК. Через 3 нед. после забора десны животным выполняли пересечение медиальной Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73 головки икроножной мышцы на обеих тазовых конечностях. На 7 сут. после операции в поврежденную мышцу одной из конечностей вводили аутогенные ММСК альвеолярной десны, в мышцу контралатеральной конечности - эквивалентный объем 0,9% раствора NaCl (контроль). Животных выводили из эксперимента перед введением клеток (0 сут.) и на 21, 35 сут. после. При этом для гистологического исследования забирали икроножные мышцы с обеих сторон. Анестезия Все хирургические манипуляции выполнялись под общим обезболиванием, анестезия обеспечивалась внутримышечным введением препарата «Золетил 100» и 2% раствора ксилазина гидрохлорида, дополнительно выполнялась местная анестезия 2% раствором лидокаина. Биопсии десны и мышцы В условиях операционной с соблюдением правил асептики всем животным выполняли биопсию альвеолярной и прикрепленной десны во фронтальном отделе нижней челюсти. Объем биоптата составлял 3-4 мм3. Дополнительно трем животным при выведении из эксперимента выполняли биопсию длиннейшей мышцы спины, объем биоптата составлял 1-1,5 см3. Биоптаты помещали в стерильные пробирки (BD Falcon, США) с транспортировочной питательной средой: a-MEM (Sigma, США), 2% FBS (HyClone, США), 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мг/мл стрептомицина, 200 ЕД/мл амфотерицина (Stem Cell Technologies, США) - маркировали и доставляли в течение 2 ч. при температуре +4°С в лабораторию. Выделение и культивирование клеток Все манипуляции с биоматериалом были выполнены в соответствии со стандартами GTP (Good tissue practice), а также стандартными операционными процедурами, принятыми в Центре биомедицинских технологий ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой». Все биоптаты обрабатывали по единому протоколу, представленному ниже. Биоптаты инкубировали при 4°С в течение 2-3 ч. в среде DMEM/ F1 2 (Stem Cell Technologies, США) с добавлением 10% FBS (Biological Industries, Израиль), после чего подвергали ферментативной обработке 0,15% раствором коллагеназы II типа (Sigma, США) при 37°С в течение 12 ч. Для получения первичной культуры изолированную суспензию клеток дважды отмывали средой DMEM/F12(Stem Cell Technologies, США) с добавлением 15% FBS (Biological Industries, Израиль) и переносили в той же среде во флакон площадью 25 см2 (NUNC, США). По достижении 70% конфлюэнтности культуры снимали с поверхности пластика при помощи 0,05% раствора трипсина/ ЭДТА (Stem Cell Technologies, США). Клетки культивировали при 37°С и 5% СО2 до 2 пассажа с заменой среды каждые 3 сут. Для подсчета и оценки жизнеспособности клеток использовали автоматический счетчик клеток «Countess» (Invitrogen, США). Визуальное наблюдение за ростом культур и морфологией клеток осуществляли при помощи фазовоконтрастной микроскопии. Остеогенная, адипогенная и хондрогенная дифференцировка Для индукции остеогенной и адипогенной дифференцировки клетки рассевали с высокой плотностью 5х103/см2 в 6-луночные планшеты (NUNC, США) и культивировали до субконфлюэнтного состояния в среде DMEM/F12 с добавлением 15% FBS (Biological Industries, Израиль). В дальнейшем для оценки остеогенного потенциала стандартную культуральную среду заменяли на индукционную, содержащую дексаметазон, аскорбат, добавку для мезенхимальных клеток, L-глутамин, ß-глицерофосфат, гентамицин/амфотерицин В (Lonza Walkersville, США), и инкубировали клетки в течение 3 нед. Для индукции адипогенеза стандартную культуральную среду заменяли на среду, содержащую человеческий рекомбинантный инсулин, добавку для мезенхимальных клеток, L-глутамин, дексаметазон, индометацин, 3-изобутил-метилксантин и гентамицин/амфотерицин В (Lonza Walkersville, США). Контрольные образцы культивировали в течение 3 нед. в поддерживающей адипогенной среде, содержавшей человеческий рекомбинантный инсулин, добавку для мезенхимальных клеток, L-глутамин гентамицин/амфотери-цин В (LonzaWalkersville, США). Для подтверждения остеогенной дифференцировки культуры клеток фиксировали холодным раствором 70% этанола в течение 10 мин., отмывали дистиллированной водой и окрашивали в течение 1 0 мин. при комнатной температуре раствором ализаринового красного (Sigma, США), после чего отмывали деионизированной водой. Для подтверждения адипогенной диф-ференцировки культуры клеток фиксировали холодным 4% раствором параформальдегида в течение 10 мин. и отмывали 60% изопропиловым спиртом. Фиксированные клетки окрашивали при комнатной температуре 2% раствором масляного красного О (Sigma, США), после чего отмывали деионизированной водой. Для индукции хондрогенной дифференцировки суспензию 2,5х105 клеток в 20 мкл помещали в центр покровного стекла на 30 мин. для полной адгезии, а затем выращивали в среде, содержавшей дексамета-зон, аскорбат, инсулин-трансферрин-селенит, добавку для мезенхимальных клеток, L-глутамин, пируват натрия, пролин, трансформирующий фактор роста^3, гентамицин/амфотерицин В (Lonza Walkersville, США). Контрольные образцы инкубировали в неполной индукционной среде (без добавления трансформирующего фактора ростаф3). Смену среды осуществляли каждые 3 сут., анализ культур проводили через 3 нед. По окончании культивирования клетки фиксировали 4% параформальдегидом, проводили перме-абилизацию мембран 0,3% раствором TritonX-100 (Sigma, США) и блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере (Sigma, США) в течение 60 мин. при 37°С. Экспрессию аггрекана определяли иммуноцитохими-ческим методом. Для этого использовали первичные моноклональные мышиные антитела к аггрекану кролика (MA3-16888, ThermoFisher, США) и вторичные антитела, меченые Alexa 488 (A21200, ThermoFisher, США). Для визуализации ядер использовали краситель Hoechst 33342 (H21492, ThermoFisher, США). Анализ проводили с помощью микроскопа Axioplan 2, камеры AxiocamHRc и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 74 оригинальные исследования Миогенная дифференцировка Для индукции миогенной дифференцировки клетки рассевали с высокой плотностью 1х104/см2, культивировали несколько сут.в среде DMEM/F12, 20% FBS (HyClone, США) до 100% конфлюэнтного монослоя, затем среду заменяли на DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, США) с добавлением 2% лошадиной сыворотки (Biological Industries, Израиль) и инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение 5-10 дней до формирования вытянутых многоядерных структур. Для подтверждения миогенной дифференцировки клетки, посеянные на предметные стекла, фиксировали 4% параформальдегидом. Затем культуры инкубировали с первичными антителами, специфичными к ядерному фосфопротеину MyoD1 (клон 5.8A, Dako, Дания) и миогенину (клон F5D, Dako, Дания), с последующим окрашиванием вторичными антителами, мечеными Alexa 488 (LifeTechnologies, США). Съемку изображений проводили при помощи микроскопа Axioplan 2, камеры AxiocamHRc и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Подготовка клеточного продукта для введения животным Для введения лабораторным животным использовали аутогенные ММСК альвеолярной десны, инкубированные в индукционных условиях в течение 4 сут. Непосредственно перед экспериментом клеточные культуры снимали с поверхности культурального пластика при помощи 0,05% раствора трипси-на/ЭДТА (Stem Cell Technologies, США) и отмывали стерильным физиологическим раствором. Клеточный осадок растворяли в 200 мкл 0,9% раствора NaCl. Количество клеток в 200 мкл раствора для введения составляло 3 млн. Каждую суспензию клеток помещали в инсулиновый шприц, маркировали и стерильно упаковывали. Время от упаковки до введения составляло не более 5 ч. Протокол операции На первом этапе выполняли пересечение медиальной головки икроножной мышцы на обеих ногах кроликов. Для этого рассекали кожу заднемедиальной поверхности голени, медиальную головку икроножной мышцы выделяли тупым путем и пересекали скальпелем. Концы пересеченной мышцы сшивали однорядным узловым швом нерассасывающейся нитью 5/0. Рану промывали водным раствором хлор-гексидина биглюконата и ушивали наглухо нерасса-сывающейся нитью 3/0. На втором этапе исследования вводили аутогенные ММСК. Для этого, снимали кожные швы, послеоперационный рубец в области голени иссекали, визуализировали шов мышцы. В икроножную мышцу одной конечности вводили суспензию аутогенных клеток: по 100 мкл проксимальнее и дис-тальнее уровня пересечения; в икроножную мышцу контрлатеральной конечности вводили 200 мкл 0,9% раствора NaCl. Препарат вводили на глубину 2-3 мм от поверхности мышцы, на расстоянии 1-4 мм от уровня пересечения. Всего выполняли 10 инъекций (по 5 проксимальнее и дистальнее уровня пересечения) в мышцу каждой конечности. Рану обрабатывали водным раствором хлоргексиди-на, кожу ушивали наглухо. В послеоперационном периоде животным проводили обезболивание в течение 1 сут. и внутримышечное введение антибактериального препарата (цефазолина) в течение 5 сут. Кожные швы после второго этапа эксперимента снимали на 10 сут. Гистологическое исследование Полученный материал фиксировали в 4% забуфе-ренном формалине, заливали в парафин по стандартной методике, изготавливали парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм. После депарафинизации-реги-дратации срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори, производили иммуногистохими-ческие реакции с антителами к а-гладкомышечному актину (а-ГМА, клон 1A4, Dako, Дания, разведение 1:50), факторам мышечной дифференцировки MyoD (клон 5.8A, Dako, Дания, разведение 1:100) и миогенину (клон F5D, Dako, Дания, разведение 1:100), маркеру пролиферации Ki-67 (клон SP6, Abcam, США, разведение 1:200), тяжелым цепям быстрого и медленного миозинов (MHCfast, клон My-32, Sigma, США, разведение 1:500, MHCslow, клон NOQ7.5.4D, Sigma, США, разведение 1:2000). В качестве системы детекции использовали коммерческий набор Novolink (Novocastra, Великобритания), в качестве хромогена - аминоэтилкарбазол, ядра докрашивали гематоксилином. Окрашенные срезы фотографировали c помощью светового микроскопа Axiolmager Z2 (Carl Zeiss, Germany), гистотопограммы получали с помощью сканера предметных стекол AperioCS2 (Leica Microsystems, Germany), полученные изображения подвергали морфометрическому анализу с помощью графического пакета ImageJ (NIH, США, открытая лицензия). В ходе морфометрического анализа производили оценку трёх областей в каждом исследуемом образце: зону некроза, паранекротическую зону и зону условно здоровой мышечной ткани, которая располагалась на периферии срезов и представляла собой интактную скелетную мышечную ткань. Область некроза определяли по следующим критериям: наличие некротизированных мышечных волокон с их замещением соединительной тканью, наличие единичных центральноядерных мышечных волокон, присутствие «грануляционной ткани» и демаркационного воспаления. Границы и протяженность па-ранекротической области определяли по наличию жизнеспособных мышечных волокон с лейкоцитарной инфильтрацией между ними, преобладанию центральноядерных мышечных волокон и мышечных волокон малого диаметра в сочетании с отдельными некротизированными мышечными волокнами. На гистотопограммах срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, измеряли протяженность зоны повреждения (некротическая и паранекроти-ческая области) в мм. На срезах, окрашенных по Маллори, при увеличении х200 производили вычисление доли площади, занимаемой фиброзной тканью, по отношении к общей площади среза (в %) в 10 случайных полях зрения в области некроза и в 20 случайных полях зрения в паранекротической области и в области условно здоровой мышцы (по 10 с каждой стороны от области некроза). На срезах, окрашенных с антителами к а-ГМА, определяли количество сосудов в поле зрения при увеличении х200, всего по 10 случайных полях зрения в каждой области. Гены & клетки Том XII, № 2, 2017 оригинальные исследования 75 На срезах, окрашенных с антителами к Ki-67, определяли долю Ki-67-позитивных ядер от общего количества ядер в 5 случайных полях зрения в каждой из областей на увеличении х400. На срезах, окрашенных с антителами к MyoD и myogenin, определяли долю позитивно окрашенных ядер от общего количества ядер в 10 случайных полях зрения из каждой области на увеличении х400. На срезах, окрашенных с антителами к MHCfast и MHCslow, в 10 идентичных полях зрения в каждой из областей на увеличении х200 подсчитывали долю волокон, экспрессирующих тяжелые цепи быстрых и медленных миозинов, по отношению к общему количеству волокон. Статистический анализ При статистической обработке полученных данных для выявления соответствия распределения признаков закону нормального распределения применяли критерий Шапиро - Уилка. Учитывая непараметрическое распределение данных, результаты морфометрического анализа представлены в виде «медиана (25 процентиль-75 процентиль)». Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Вилкоксона для связанных выборок и IJ-критерия Манна - Уитни при сравнении контрольной и экспериментальной групп, различия считали статистически значимыми при р<0,05. В работе использовали программное обеспечение R 3.2.4 (RFoundation). Результаты и обсуждение На первом этапе работы была подтверждена способность 10 культур ММСК альвеолярной десны, полученных от разных животных, к мультипотентной дифференцировке (адипогенной, остеогенной, хон-дрогенной) (рис. 1). В дальнейшем для тех же культур была подтверждена способность к дифференцировке в миогенном направлении. По аналогии с ММСК человека [14], при культивировании клеток альвеолярной десны в среде с миогенными факторами во всех исследуемых культурах (n = 10) на 5-10 сут. было отмечено формирование многоядерных мышечных трубочек (рис. 2). В контрольных культурах данные структуры не образовывались. При иммуноцихимическом исследовании в вытянутых многоядерных волокнах выявлена экспрессия маркеров ранней дифферен-цировки клеток-предшественниц ППСМТ: MyoD1 и миогенина. Схожие результаты получены при индукции миогенной дифференцировки в культурах клеток мышечной ткани кролика (n = 6), использованных в качестве положительного контроля. В то же время ММСК прикрепленной десны кролика (n = 10) в аналогичных условиях не дифференцировались в миогенном направлении (рис. 2). Для введения лабораторным животным использовали аутогенные ММСК подвижной десны, пред-дифференцированные в миогенном направлении, до начала слияния клеток и образования многоядерных миотуб (4 сут. после начала индукции). У двух животных в послеоперационном периоде на одной из конечностей были отмечены признаки развития воспалительного процесса, в связи с этим они были исключены из дальнейшего исследования. При проведении гистологического анализа установлено формирование четко отграниченной зоны повреждения в области пересечения медиальной головки икроножной мышцы к моменту введения клеток. После введения ММСК десны наблюдали значительное ее уменьшение по сравнению с мышцами контралатеральной конечности (контроль) на 21 (p<0,05) и 35 сут. (p<0,01) (рис. 3). Следует отметить, что в контроле размеры зоны повреждения оставались практически неизменными на протяжении всего срока наблюдения. Адипо- Остео- Хондро- .Û § О. О CÜ 03 о О. Ф О. Ф -8 -8- Рис. 1. Культура ММСК альвеолярной десны кролика: результат индукции дифференцировки в адипо-, остео-и хондрогенном направлениях. Докраска ядер - DAPI. Масштабный отрезок - 50 мкм Гены & клетки Том XII, № 2, 2017 76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ А Прикрепленная десна Альвеолярная десна Мышечная ткань Рис. 2. Первичные (контроль) и индуцированные в миогенном направлении культуры стромальных клеток ППСМТ, альвеолярной и подвижной десны кролика: А - фазово-контрастная микроскопия; Б - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к миогенину и MyoD1. Докраска ядер - DAPI. Масштабный отрезок: А - 100 мкм, Б - 20 мкм Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 77 В I эксперимент I контроль Рис. 3. Протяженность зоны повреждения через 21 сут.: А - зона повреждения (некротическая и паранекротическая), контроль; Б - зона повреждения (некротическая и паранекротическая) после введения ММСК десны; В - протяженность зоны повреждения (некротической и паранекротической) в мышечной ткани экспериментальной и контрольной групп; * - p<0,05. Окраска: А, Б - гематоксилин и эозин. Ув. х40 Сутки после пересечения Как известно, процессы гистогенеза, включая ре-паративный гистогенез, включают в себя последовательную смену преимущественных процессов в тканях - пролиферацию и миграцию, дифференцировку различных клеток-предшественниц, выполнение ими специфических функций и др. Причем на органном уровне репаративный процесс сопровождается развитием временной структуры, богатой кровеносными сосудами,- грануляционной ткани, с последующим ремоделированием регенерата. Изучение пролиферации через детекцию белка Ki-67 выявило тенденцию к снижению пролиферативной активности вследствие введения ММСК десны на 21 и 35 сут. во всех областях поврежденной мышцы. При этом в контроле в зоне некроза на 35 сут. доля Ki-67-позитивных ядер была значимо выше, чем в мышцах, в которые вводили ММСК десны (p<0,01) (рис. 4). Установлено, что к 21 и 35 сут. количество кровеносных сосудов снижалось в условно-здоровой, паранекротической и в некротической зонах оперированной мышцы. Данная находка является вполне закономерной с учетом того, что активное формирование сосудовначинается после перехода пост-травматического воспаления в продуктивную фазу. Морфометрический анализ также выявил достоверное снижение количества кровеносных сосудов в условно здоровой мышечной ткани экспериментальной группы по сравнению с контролем на 35 сут. (p<0,001) без статистически значимых различий в других областях (рис. 5). Анализ выработки факторов миогенной дифференцировки MyoD и миогенина указывает на активированный репаративный рабдомиогенез в скелетной мышце после введения клеток: наблюдалась тенденция к увеличению доли MyoD-позитивных клеток (активированных миогенных клеток-предшественниц) на 21 сут. в некротической, паранекротической зонах и зоне неповрежденной ППСМТ, при этом их количе ство было статистически значимо выше на 21 сут. в паранекротической области (p<0,01) (рис. 6). Кроме того, при иммуногистохимическом анализе на миогенин (маркер дифференцированных миосателлитоцитов и миотуб) отмечено значимое увеличение доли миогенин-позитивных клеток в мышцах после введения ММСК десны в зоне некроза на 21 сут. (p<0,01), что отражает усиление процессов миогенной дифференцировки клеток (рис. 7). При этом к 35 сут. количество миогенин-позитивных клеток в паранекротической зоне было достоверно выше в контроле (р<0,01), что, вероятно, обусловлено более ранней активацией репа-ративных процессов в экспериментальной группе (рис. 7). Большее количество ранних предшественников миогенеза в паранекротичекой зоне по сравнению с постепенно уменьшающейся некротической зоной свидетельствует о том, что в последней еще преобладают пролиферативно-миграционные процессы, в то время как события мышечной дифференци-ровки развиваются именно в пограничной зоне. Необходимо отметить значимое увеличение доли миогенин-позитивных клеток в условно здоровой мышечной ткани экспериментальной группы на 21 сут. (р<0,05) (рис. 7). Такие различия могут быть обусловлены миграцией введенных ММСК десны и (или) активацией дифференцировки миосател-литоцитов здоровой мышечной ткани под влиянием факторов, вырабатываемых введенными клетками. Безусловно, однозначный ответ о механизмах, лежащих в основе выявленных различий, даст только исследование с использованием меченых клеток. Вместе с тем, установленный факт с учетом данных о пролиферации позволяет сделать заключение о преобладании процессов дифференцировки над пролиферацией в поврежденных мышцах животных под прямым или опосредованным влиянием введенных ММСК десны на изученных (поздних) сроках восстановительного процесса. Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 78 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ А Б В 11 I- '"“LSI“ Т =@=1 Сутки после введения ММСК десны Сутки после введения ММСК десны Сутки после введения ММСК десны I эксперимент I контроль ^ïff kV *L;,r y*/Kl j ? Рис. 4. Ki-67-позитивные клетки в зоне повреждения в различные сроки после введения ММСК десны. А-В - графическое отображение количественных данных по областям: доля Ki-67-позитивных ядер в области некроза (А), паранекротической области (Б) и области здоровой ткани (В); * - p<0,05; Г, Д - скелетная мышца в области некроза на 35 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (Г) или ММСК десны (Д); Ki-67-позитивные ядра красно-фиолетового цвета отмечены стрелками; Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к Ki-67. Докраска ядер гематоксилином. Ув. х400 В £ О Я jo £ £ т £ 40 £■ зо S 5 20 6 І 10 I о О 21 25 Сутки после введения ММСК десны I эксперимент I контроль Рис. 5. Скелетная мышца в области условно здоровой зоны: А - 35 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (контроль); Б - 35 сут. после введения ММСК; В - количество сосудов в различные сроки после введения ММСК десны; *- p<0,05. Иммуногистохимическая реакция с антителами к а-ГМА. Докраска ядер гематоксилином. Ув. х200 Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 оригинальные исследования 79 А Б В Сутки после введения ММСК десны Сутки после введения ММСК десны Сутки после введения ММСК десны Рис. 6. MyoD-позитивные клетки в зоне поврежденияв различные сроки после введения ММСК десны. А-В - графическое отображение количественных данных по областям: доля MyoD-позитивных клеток в области некроза (А), паранекротической области (Б) и области здоровой ткани (В); * - p<0,05; Г, Д - скелетная мышцапаранекротической области на 21 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (Г) или ММСК десны (Д), стрелками отмечены MyoD-позитивные клетки красного цвета; Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к MyoD. Докраска ядер гематоксилином. Ув. х400 А Б В Рис. 7. Миогенин-позитивные клетки в зоне поврежденияв различные сроки после введения ММСК десны. А-В - графическое отображение количественных данных по областям: доля миогенин-позитивных клеток в области некроза (А), паранекротической области (Б) и области здоровой ткани (В); * - p<0,05; Г, Д - скелетная мышцав области некрозана 21 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (Г) или ММСК десны (Д), стрелками отмечены миогенин-позитивные ядра. Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к миогенину. Докраска ядер гематоксилином. Ув. х400 Гены & клетки Том XII, № 2, 2017 80 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Анализ экспрессии тяжелых цепей быстрого/ медленного миозинов не выявил значимой ко-экспрессии обеих изоформ, доля мышечных волокон, экспрессирующих тяжелые цепи медленного миозина, обратно пропорциональна доле мышечных волокон, экспрессирующих тяжелые цепи быстрого миозина. Поэтому для удобства представлены результаты только по мышечным волокнам, экспрессирующим тяжелые цепи быстрого миозина. Введение ММСК десны не оказывало значимого влияния на композицию мышечных волокон в некротической и паранекротической области, при этом в области условно здоровой мышцы на 21 сут. введение ММСК десны вызывало значимое повышение содержания быстрых мышечных волокон (p<0,001) (рис. 8). Оценка ремоделирования мультитканевого регенерата после окрашивания по Маллори позволила установить, что на 21 сут. в области некроза в мышце, инфильтрированной ММСК десны, доля фиброзной ткани значительно и значимо ниже, чем в контрольной (p<0,01) (рис. 9). Таким образом, введение ММСК десны снижает к 21 сут. степень фиброза в некротической области, создавая условия для более полной регенерации мышечной ткани. Кроме того, введение ММСК десны вероятно не вносит дополнительного вклада в формирование соединительнотканного рубца и не способствует фи-брозированию мышечной ткани. Заключение Введение аутогенных ММСК десны на модели «разрезания-сшивания» скелетной мышцы кролика способствовало значительному сокращению размеров области повреждения мышцы. Данный эффект обусловлен активацией репаративного рабдомиоге-неза под влиянием введенных клеток, что сопровождалось увеличением количества активированных и терминально дифференцированных миогенных кле-ток-предшественниц либо за счет прямой дифферен-цировки введенных ММСК, либо за счет активации дифференцировки миосателлитоцитов поврежденной мышцы под влиянием факторов, вырабатываемых трансплантированными клетками. Аналогичные процессы были обнаружены и на отдалении от очага повреждения. Активация процессов миогенной диф-ференцировки на изученном временном отрезке репарации также подтверждалось сниженной пролиферативной активностью в скелетной мышце экспериментальной группы. При этом локальная инъекция ММСК десны в значительной степени не влияла на композицию поврежденной скелетной мышцы в отношении типов мышечных волокон. Важно отметить, что введение ММСК десны не оказывало фиброгенного воздействия на скелетную мышечную ткань и даже замедляло темпы формирования соединительнотканного рубца, создавая условия для более полной регенерации мышечной ткани. А Б В Сутки после введення ММСК десны * Сутки после введения ММСК десны I эксперимент I контроль ” JiiliP 1 V hr. «r; .І і * * Рис. 8. Мышечные волокна, экспрессирующие тяжелые цепи быстрого миозина, в зоне повреждения в различные сроки после введения ММСК десны. А-В - графическое отображение количественных данных по областям: доля мышечных волокон в области некроза (А), паранекротической области (Б) и области здоровой ткани (В); *- p<0,05; Г, Д - скелетная мышца условно здоровой области на 21 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (Г) или ММСК десны (Д), быстрые мышечные волокна красного цвета. Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к MHCfast. Докраска ядер гематоксилином. Ув. х200 Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 оригинальные исследования 81 АБВ Рис. 9. Фиброзная ткань в зоне повреждения в различные сроки после введения ММСК десны. А-В - графическое отображение количественных данных по областям: доля фиброзной ткани в области некроза (А), паранкеротической области (Б) и области здоровой ткани (В); *- p<0,05; Г, Д - скелетная мышцав области некрозана 21 сут. после введения 0,9% раствора NaCl (Г) или ММСК десны (Д), соединительная ткань голубого цвета, мышечные волокна - желтого. Окр. Г, Д - по Маллори. Ув. х200 Таким образом, аутогенные ММСК альвеолярной десны могут рассматриваться как потенциально эффективный агент для применения при механических повреждениях мышечной ткани в качестве средства, способствующего ускорению репаративной регенерации и профилактики фиброза.

About the authors

I. N Korsakov

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow

Email: ikorsakov@yandex.ru

D. P Samchuk

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow

A. A Pulin

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow

M. O Mavlikeev

Kazan (Volga region) Federal University

O. N Chernova

Kazan (Volga region) Federal University

A. A Titova

Kazan (Volga region) Federal University

R. V Deev

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow; Human Stem Cells Institute; I.P. Pavlov Ryazan State Medical University named after academician

I. Y Bozo

Human Stem Cells Institute; A.I. Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of FMBA of Russia

V. L Zorin

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow; Human Stem Cells Institute

I. I Eremin

Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow

O. V Denisova

Professional Development Institute of Federal Medical Biological Agency of Russia

A. S Karpukhina

“DiaLab plus”Co. Ltd

A. Yu Gorodkov

A.N. Bakulev Scientific Center for Cardiovascular Surgery

K. V Kotenko

Central State Medical Academy, Moscow

P. B Kopnin

N.N. Blokhin Cancer Research Center

References

Supplementary files