Expression dynamics of the serotonergic system components in granulosa cells of the developing ovarian follicle and after luteinization

Full Text

Введение Являясь одним из классических нейротрансмиттеров, серотонин обладает целым спектром регуляторных функций вне нервной системы, как в эмбриональном развитии, так и во взрослом организме [1]. В частности, для многих животных, в том числе млекопитающих [2-4], показано участие серотонина в регуляции процессов роста и созревания женских половых клеток. Серотонин в физиологических концентрациях определяется в яичниках млекопитающих, в изолированных ооци-тах и клетках кумулюса [5], а также в фолликулярной жидкости [6]. На различных моделях показано, что серотонин обладает активирующим действием на функционирование фолликулярных клеток. У хомячков и крыс серотонин стимулирует синтез эстради-ола в преовуляторных фолликулах, культивируемых in vitro, а специфические антагонисты серотони-новых рецепторов устраняют этот эффект [2, 3]. Активирующий эффект серотонина наблюдается и на клетках гранулезы человека [7, 8]. У мышей с нокаутом гена транспортера серотонина Sert угнетена экспрессия ароматазы Cyp19a1 и, как следствие, уменьшается содержание эстрадиола в крови. Аналогичный эффект вызывает специфический ингибитор обратного захвата серотонина пароксетин [9]. Сходные результаты получены и на других модельных объектах, например, у самок костистой рыбы Danio rerio ингибитор обратного захвата серотонина флуоксетин приводит к уменьшению количества икры и содержания эстрадиола в яичниках, а также к снижению уровня экспрессии мРНК овариальной ароматазы и рецепторов к гонадотропным гормонам [10]. Конкретные механизмы функционирования серо-тонинергической сигнальной системы в компонентах овариальных фолликулов описаны в литературе далеко не полно. Данных о динамике экспрессии компонентов серотонинергической системы в развивающемся овариальном фолликуле фактически нет, так как большая часть работ выполнена на фолликулярных клетках, выделенных из преовуляторных фолликулов, или ооцит-кумулюсных комплексах [5, 11]. Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 34 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С целью решения этих вопросов, и для устранения имеющихся пробелов нами был выполнена полная оценка экспрессии мРНК всех компонентов серото-нинергической системы в фолликулярных клетках, исследована динамика их экспрессии в ходе фолли-кулогенеза, а также при лютеинизации. материал и методы В работе использовали 30 самок мышей-гибридов F1 линий C57BL/6J и CBA/J в возрасте 2 мес. Содержание животных в одинаковых стандартных условиях вивария и проведение экспериментов осуществлялись в соответствии с международными правилами гуманного обращения с лабораторными животными [12]. Получение материала проводили с применением стандартных методик [13], отдельной пробой являлись клетки, полученные из яичников одной самки. Яичники препарировали в среде L-15 (Sigma-Aldrich, США) под контролем стереомикроскопа. Первичные многослойные фолликулы размером 100-175 мкм изолировали механически двумя острыми иглами и диссоциировали на клетки в растворе 1 мг/мл коллагена-зы I (Sigma-Aldrich, США) и 100 мкг/мл ДНКазы I (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. при 37°С и 5% CO2. Клетки гранулезы из антральных и преовуляторных фолликулов размером 200-250 мкм и 400-450 мкм, соответственно, получали посредством пункции тонкой иглой. Желтые тела выделяли микрохирургически из яичников беремен ных (5,5 сут.) самок. Положительным контролем служила РНК, выделенная из целого плода на 18 день эмбрионального развития. Тотальную РНК из полученных проб выделяли с использованием TRI Reagent (Sigma-Aldrich, США) и обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, США), согласно протоколам фирм-производителей. Библиотеки кДНК синтезировали с помощью набора реактивов «MMLV RT kit» (Евроген, Россия), используя рандомные гексаолигонуклеотиды и 2 мкг РНК в качестве матрицы. ПЦР проводили на амплифика-торе T100 (BIO RAD, США) с применением готовой смеси для ПЦР «ScreenMix-HS» (Евроген, Россия). Продукты ПЦР анализировали с помощью агарозного гель-электрофореза и системы видеорегистрации «Взгляд» (Хеликон, Россия). ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием коммерческой смеси qPCR-HS SYBR + LowROX (Евроген, Россия) и программного обеспечения 7500 Software (Applied Biosystems, США). Относительную экспрессию генов рассчитывали методом dCt [14], контрольный ген - Hprt. Специфические олигонуклеотиды для проведения ПЦР (табл.) подбирали с помощью сервиса NCBI Primer-BLAST с учетом эк-зон-интронной структуры генов. Каждый эксперимент был проведен в пяти повторностях. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., США) с применением Ll-критерия Манна - Уитни. таблица. Специфические олигонуклеотиды для проведения ПЦР. Температура отжига для всех праймеров 60°C Название гена NCBI GenelD Последовательности прямых (f) и обратных (r) праймеров (5->3) Длина продукта ПЦР, пн Tph1 f TGCGACATCAGCCGAGAACAGT 162 21990 r GGCGCAGAAGT CCAGGT CAGA Tph2 f CATGGCTCCGACCCCCTCTACA 219 216343 r ATACGCCCGCAGTTGACCCTCTT Ddc f TCCCCACGGCTAGCTCATACCC 133 13195 r TTCCCCAGCCAGTCCATCATCA Sert (Slc6a4) f GGGAGACCTGGGGCAAGAAG 182 15567 r CAGGGCGAGCTCCATGTAGAAGA Vmat1 (Slc18a1) f AGAGGCCCACGAAGGAGTT 180 110877 r TGCCCAGAGGAGAGGAAAGT Vmat2 (Slc18a2) f CCACTGTCCAGCTCCTCACCAACC 149 214084 r GGCGATCAGCAGGAAGGCATAGC Maoa f GCTGAGGAATGGGACAAGATAACC 166 17161 r TACCTCCACACTGCCTCACATACC Htr1a f TGCCCAGCGAATCAGGAG 374 15550 r GCCAAAGACCGAGCCAATAA Htr1b f GACCCGAGCCCAGTTGATA 170 15551 r TAGCGGCCAT GAGTTT CTT C Htr1d f ACCCGCACCTGGAACTTT 188 15552 r CAGACGGCCGCAATCAT Htr1f f CCAAGGAACTAGCCGTGATGATGA 396 15557 r AGGGTAGTGGCTGCTTTGCGTTCT Htr2a f GAAAATCATTGCGGTGTGGAC 168 15558 r ATGATGGTTAGGGGGATGAAAAA Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 оригинальные исследования 35 Окончание таблицы. Название гена NCBI GeneID Последовательности прямых (f) и обратных (r) праймеров (5->3) Длина продукта ПЦР, пн Htr2b f GAGGGACAGGGGCATACAGT 401 15559 r CAAT CGGCAT CACAAACAAT C Htr2c f GTGCTATTTT CAACTGCGTCCAT C 200 15560 r AACACTTTGCTTT CGTCCCT CAG Htr3a f TGGCGATCACCGGAAGAAGT 200 15561 r AGGAAGATACTGGGCAGCAAGAGG Htr4 f TACCACAGCATCGATCTTTCACCT 132 15562 r ACCCAGCAGCCTCCCAACATT Htr5a f GCAAGCGTGTCTCCAATGTGATGA 276 15563 r GGGTACGGGGGAGACGCTGTT Htr5b f CCTCTGGCGGTGGTGCTCTTC 157 15564 r CTCGGCGACGGGCTGTGA Htr6 f AACTGGGCAAAGCTCGAACATCTG 192 15565 r CCGTAGCCGTGCCCGTGGTGAG Htr7 f TCCCGTCTAGGCTTTGTGGTA 161 15566 r T GTTCGCT GAT GACT GGTTT CT Hprt f GCTGAGGCGGCGAGGGAGAG 148 15452 r GCTAATCACGACGCTGGGACTGC результаты В результате ОТ-ПЦР исследования экспрессии всех основных компонентов серотонинергиче-ской сигнальной системы было обнаружено, что в клетках гранулезы преовуляторных фолликулов и желтых телах экспрессируется мРНК ферментов триптофангидроксилазы Tph1, декарбоксилазы ароматических аминокислот Ddc и моноаминокси-дазы Maoa, транспортеров Sert, Vmat1 и Vmat2, рецепторов серотонина Htr1b, Htr1d, Htr2a, Htr2b, Htr5b и Htr7 (рис. 1). мРНК генов Tph2, Htr1a, Htr1f, Htr2c, Htr3a, Htr4, Htr5a и Htr6 не детектировалась в исследуемых пробах. Для выявления динамики экспрессии мРНК генов серотонинергической системы в ходе фолликулогенеза и оценки изменения их экспрессии при лютеинизации был проведен количественный анализ методом ПЦР в реальном времени (рис. 2). Рис. 1. Экспрессия компонентов серотонинергической системы в клетках гранулезы (КГ) развивающегося овариального фолликула и желтом теле (ЖТ). Положительный контроль - эмбрион 18 дней внутриутробного развития (E18), отрицательный контроль - ПЦР без матрицы (-). Контрольный ген домашнего хозяйства - гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза Hprt Гены & клетки Том XII, № 4, 2017 36 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 2. Динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы (светло-серые) и маркеров функциональной активности фолликулярных клеток (темно-серые) в клетках гранулезы в ходе фолликулогенеза и при лютеинизации: ПМФ - первичные многослойные фолликулы, АФ - антральные фолликулы, ПОФ - преовуляторные фолликулы, ЖТ - желтое тело. Относительная экспрессия (RQ) генов нормирована по гену домашнего хозяйства Hprt. Статистическая значимость различий: * p<0,1; ** p<0,05 Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 оригинальные исследования 37 Полученные результаты свидетельствуют о том, что ряд генов серотонинергической системы: Tph1, Ddc, Maoa, Sert, Htr1d, Htr2a, Htr2b - не обладают выраженной динамикой экспрессии в ходе фолликулярного роста. Это справедливо и для генов рецептора фолликулостимулирующего гормона Fshr и гена Star. При этом для мРНК гена Vmat1 наблюдается тенденция к увеличению количества на поздних стадиях, что характерно для таких маркеров функционального состояния фолликулярных клеток, как рецептор лютеинизирующего гормона Lhcgr и ключевые ферменты синтеза стероидных гормонов Cyp11a1 и Cyp19a1. В то же время, относительное количество мРНК генов Vmat2, Htr1b и Htr7 уменьшается в ходе фолликулогенеза. Такая же динамика прослеживается для маркера пролиферации Mki67. В желтых телах, по сравнению с клетками гранулезы преовуляторного фолликула, экспрессия генов Tph1, Sert, Htr1d, Htr2a и Htr2b значимо не изменяется, а для генов Htr1b, Maoa, Vmat1, Ddc наблюдается увеличение относительной экспрессии, как и в случае классических маркеров лютеинизации Lhcgr, Star, Cyp11a1. Количество мРНК генов Htr7, Vmat2, так же, как и маркеров функционального состояния фолликулярных клеток Mki67, Cyp19a1 и Fshr, уменьшается при лютеинизации. Обсуждение В фолликулярных клетках развивающегося овариального фолликула экспрессируется целый ряд компонентов серотонинергической системы, которые могут составить функционально полноценную сигнальную систему. Ранее показана экспрессия отдельных компонентов серотонинергической системы для клеток кумулюса, выделенных из ооцит-кумулюсных комплексов, и культур клеток гранулезы [15]. В нашей работе мы подтвердили литературные данные и провели полную проверку экспрессии всех компонентов серотонинергической системы, результаты которой позволяют полагать, что в фолликулярных клетках активны системы мембранного и везикулярного транспорта, деградации и рецепции серотонина, а в желтых телах, возможно, появляется синтез трансмиттера. Динамика экспрессии гена является важным показателем его функциональной активности. Выраженные изменения уровня экспрессии гена могут свидетельствовать о его функциональной активности на той или иной стадии. Так, в ходе фолликулярного роста наблюдается активация синтеза эстрогенов, которая сопровождается увеличением количества мРНК генов Cyp11a1 и Cyp19a1, кодирующих стероидогенные ферменты. Также увеличивается экспрессия гена рецептора лютеинизирующего гормона Lhcgr, играющего важную роль на поздних стадиях фолликулогенеза. Ген везикулярного транспортера моноаминов Vmat1 обладает такой же динамикой экспрессии, что может указывать на его роль в регуляции стероидогенной активности фолликулярных клеток на поздних стадиях фолликулогенеза. В то же время, для ранних стадий фолликулярного роста характерна повышенная способность фолликулярных клеток к пролиферации, которой сопутствует увеличенная экспрессия мРНК меркера Mki67. Везикулярный транспортер моноаминов Vmat2 и рецепторы серотонина Htr1b и Htr7 экспрессируются на более высоком уровне в первичных фолликулах, что может говорить о возможной роли этих генов в регуляции пролиферативной активности клеток гранулезы на ранних стадиях фолликулогенеза. В пользу этого предположения говорит то, что серотонин является регулятором пролиферативной активности различных типов клеток, как в норме, так и при патологиях [16-18]. В норме после овуляции фолликулярные клетки достигают терминальной стадии дифференциров-ки и становятся большими клетками желтого тела. Преждевременная лютеинизация известна как одна из причин бесплодия [19] и считается негативным явлением при культивировании клеток гранулезы [20]. Процесс лютеинизации сопряжен с изменением уровня экспрессии ряда генов [21]. Активация усиленного синтеза прогестерона происходит на фоне увеличения экспрессии генов Cyp11a1 и Star, а также рецептора к лютеинизирующему гормону и хорионическому гонадотропину Lhcgr. В то же время в желтом теле увеличивается экспрессия таких компонентов серотонинергической ситемы, как Ddc, Vmat1, Maoa, Htr1b, которые, по всей вероятности, играют роль в функционировании желтого тела. В то же время экспрессия ряда генов, наоборот, падает при лютеинизации - это характерно для ароматазы Cyp19a1, рецептора Fshr и маркера пролиферации Mki67. Такую же картину мы видим для Vmat2 и Htr7. Именно эти гены можно считать возможными эффекторами серотонинергической регуляции функционального состояния фолликулярных клеток во время фолликулогенеза. Полученные данные отражают динамику экспрессии мРНК, однако регуляция экспрессии и активности генов может происходить на последующих стадиях трансляции и посттрансляционных модификаций. Безусловно, активность генов серотонинергической системы на тех или иных стадиях фолликулогенеза в последующем необходимо подтвердить, используя методы выявления белка. Тем не менее, мы видим, что в ходе фолликулярного роста и при лютеиниза-ции экспрессируются гены ряда компонентов серо-тонинергической сигнальной системы. Отдельные ее компоненты, а именно Vmat1, Vmat2, Htr1b, Htr2b, Htr7, обладают выраженной динамикой экспрессии мРНК в ходе фолликулярного роста, что указывает на их возможную роль в качестве регуляторов функционального состояния фолликулярных клеток на той или иной стадии фолликулогенеза. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о перестройке серотонинергической системы, происходящей во время лютеинизации. Ряд генов, такие как Ddc, Maoa, Vmat1, Htr1b, можно считать количественными маркерами лютеинизации и использовать для контроля этого процесса в работах по культивированию фолликулярных клеток. При этом гены Vmat2 и Htr7, напротив, являются маркерами фолликулярной стадии.

About the authors

D. A Nikishin

N.K. Koltzov Institute of Developmental Biology of the RAS; M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: denisnikishin@gmail.com

N. M Alyoshina

M.V. Lomonosov Moscow State University

M. L Semenova

M.V. Lomonosov Moscow State University

Y. B Shmukler

N.K. Koltzov Institute of Developmental Biology of the RAS

References

Supplementary files