Non-human primate oesophagus decellularization

Full Text

Во всем мире ежегодно более чем у 500 000 человек диагностируют рак пищевода [1] и по современному прогнозу эта цифра увеличится до 850 000 человек к 2030 г. [2]. Рак пищевода среди злокачественных заболеваний является одним из наиболее агрессивных по течению и неблагоприятных по прогнозу для жизни пациентов. В структуре всех злокачественных заболеваний рак пищевода составляет 3% и занимает 6-е место, среди опухолей желудочно-кишечного тракта - 3-е место (после рака желудка и прямой кишки). Пик заболеваемости приходится на возраст 50-60 лет [3]. Около 30% пациентов с раком пищевода, а также пациенты с травматическими и врожденными нарушениями (частота встречаемости от 1:2500 до 1:4500 новорожденных) нуждаются в резекции пищевода. Существуют разнообразные тактики по восстановлению пассажа пищи, в том числе с формированием неопищевода из участка желудка [4], толстого и тонкого отделов кишечника [5]. Однако, данные реконструктивные операции очень сложны, связаны со значительным количеством послеоперационных осложнений [6], а также высокой летальностью [7]. В течение двух лет после подобных операций многие пациенты страдают от дисфагии в результате образования стриктур и, как правило, нуждаются в повторных эндоскопических вмешательствах для бужирования пищевода [8]. Тканевая инженерия, которая позволяет создавать биологическую конструкцию для замены поврежденного или удаленного органа в лабораторных условиях, обладает огромным потенциалом для улучшения качества жизни таких больных. Кроме того, пациенты, которые сегодня считаются неоперабельными из-за плохого клинического статуса, могут получить шанс на выздоровление. Предыдущие исследования в области тканевой инженерии пищевода были сосредоточены на применении децеллюляризированного матрикса под-слизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи для пластики пищевода. К сожалению, использование данного материала для замещения пищевода у свиней оказалось безуспешным [9] из-за высокой частоты развития послеоперационных стенозов. Применение децеллюляризированного матрикса подслизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи оказалось успешным лишь только при замещении им небольших дефектов в нативном пищеводе, в то время как сегментарная имплантация подобного каркаса была неудачной ввиду развивающейся дисфункции пищевода [10]. Также подобный матрикс использовался и у собак. Было показано отсутствие полной эпителизации и регенерации скелетной мускулатуры в трансплантате [11]. R. Ackbar и соавт. (2012) провели успешную децеллюляриза-цию пищевода овец с сохранением его ультраструктуры [12]. Totonelli G и соавт. в 2013 г. опубликовали работу, посвященную созданию децеллюляризиро-ванного пищевода свиньи при помощи детергент-энзиматического метода и изучили ультраструктуру полученного каркаса, успешно показав возможность использования подобного матрикса в тканевой инженерии пищевода [13]. S. Sjoqvist и соавт. (2014) описывают методику создания децеллюляризированного каркаса пищевода крысы, повторяющего архитектонику нативного органа, устойчивого к механическим нагрузкам и индуцирующего васкуляризацию [14]. Засеянные на каркас мультипотентные мезенхимальные стромаль-ные клетки (ММСК) были способны к спонтанной дифференцировке в эпителио- и мышечноподобные структуры. Рецеллюляризированный каркас использовали для ортотопической трансплантации имму-нокомпетентным крысам. Все животные выживали в течение 14 дневного эксперимента с пересаженным графтом верхней трети пищевода. В экспланти-рованных трансплантатах показана регенерация всех основных клеток и тканей пищевода, в том числе эпителия, мышечных волокон, нервов и сосудов. Тканеинженерная конструкция пищевода, на создание которой направлена данная работа, при успешных доклинических исследованиях, может в будущем спасти жизнь и обеспечить ее высокое качество большому числу пациентов с приобретенными и врожденными заболеваниями пищевода, включая протяженный стеноз, атрезию пищевода, трахео-пищеводные фистулы, ожоги, рак. Материал и методы Эксплантация органов Для создания децеллюляризированного матрикса тканеинженерного пищевода использовали органы 2 мужских особей макак-резус (Macaca mulatta). Все манипуляции с животными осуществляли с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (протокол локального этического комитета № 30/1). Материал получили в условиях операционной ГБУЗ «Научно-исследовательский институт - краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского» министерства здравоохранения Краснодарского края. Далее пищевод транспортировали в лабораторию в охлажденном растворе PBS -/- (Gibco, Англия) при температуре + 4°С. Время доставки составило не более 2 ч. В стерильных условиях с помощью пинцета и ножниц пищевод отделяли от окружающей его соединительной ткани. Один пищевод децеллюляризи-ровали, а другой использовали в качестве нативного контроля. Для проведения децеллюляризации краниальную и каудальную части пищевода канюлировали пластиковыми катетерами в соответствии с их диаметром. Орган присоединяли к перистальтическому насосу посредством соединительных трубок и помещали в специализированный биореактор ORCA (Harvard Apparatus, США). Децеллюляризация пищевода В оригинальном протоколе [14] проводилась де-целлюляризация пищевода крысы детергент-энзима-тическим методом, включающим в себя 2 цикла перфузии органа 4% раствором дезоксихолата натрия с 2000 ЕД ДНК-азы I в течение 30 мин и два цикла перфузии пищевода деионизированной водой также в течение 30 мин, причем во время второго цикла децеллюляризации в деионизированную воду был добавлен 2mM раствор ЭДТА. В завершение ткани пер-фузировали раствором PBS -/- в течение 60 мин. С целью оптимизации протокола для проведения последующей децеллюляризации пищевода, нами было увеличено время воздействия, состав и порядок перфузии децеллюляризирующими растворами. Таким образом, для децеллюляризации пищевода де-тергент-энзиматическим методом проводили 2 цикла обработки пищевода (деионизированная вода - 1 ч; дезоксихолат натрия 4% + 2mM раствор ЭДТА 1 час; PBS -/- 10 мин; свиная панкреатическая ДНКаза-I 2000 ЕД /200 мл PBS +/+ - 1 ч ), PBS -/- 200 мл -18 ч. Перфузию пищевода осуществляли со скоростью 150 мл/мин. Все растворы были стерильными, комнатной температуры (рис. 1 А, Б). Патоморфологический анализ Полученные образцы нативного и децеллю-ляризированного пищевода фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике. С помощью микротома получали срезы толщиной 5 мкм. Для общегистологической оценки препаратов проводили окраску срезов гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция). Клеточные ядра визуализировали с использованием флуорофора (4',6-диамидино-2-фенилиндола) DAPI (Sigma-Aldrich, США). Для изучения структуры внеклеточного матрикса (ВКМ) срезы окрашивали по ван Гизону (Histolab, Швеция), трихромом по Массону (Richard-Allan Scientific, США). Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX51 (Япония). Количественное определение содержания ДНК Количественную оценку содержания ДНК в нативных и децеллюляризированных органах проводили с использованием наборов реактивов (DneasyBlood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по стандартным протоколам по описанной ранее методике [17]. Исследование материала осуществлялось на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Оценка биомеханических свойств Сравнительные биомеханические тесты образцов нативного и децеллюляризированного пищевода проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Инстрон» модели 5965 (США). Все испытания проводились в воздушной среде при комнатной температуре, до момента испытания образцы хранились в среде фосфатного буфера при 4°C. Препарированные образцы пищевода (рис. 2 А,Б) растягивали с постоянной скоростью 20 мм/мин в продольном направлении. Начальное расстояние между зажимами составляло 10 мм. Статистический анализ Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программного обеспечения Excel for Office. Полученные результаты выражали в виде средних значений (M) и ошибки среднего (m). При сравнении средних значений изучаемых групп процент возможной ошибки находили по таблице t-критерия Стьюдента для парных сравнений, выражаемый в виде значений достоверности различия - «р», где р<0,05 считалось статистически достоверным. езультаты При морфологическом исследовании образцов нативного и децеллюляризированного пищевода было отмечено, что ткани органа после удаления клеток теряли характерный темно-красный цвет и становились молочно-белыми, что характерно для всех децеллюляризированных органов и соотносится с литературными данными [15-21]. Просвет пищевода становился более широким из-за отсутствия мышечной ткани. Окраска нативных тканей гематоксилином и эозином (рис. 3) показала, что слизистая оболочка органа представлена многослойным плоским неорогове-вающим эпителием, подслизистая основа - рыхлой волокнистой соединительной тканью, мышечная оболочка состоит из циркулярного и продольного слоев мышечной ткани. В препаратах децеллюляри-зированной ткани пищевода не были визуализированы сохранные ядра клеток, стенка пищевода имела характерное пористое строение. Децеллюляризиро-ванная ткань в сравнении с нативной фактически не окрашивалась как оксифильным, так и базофиль-ным красителями. Окраски тканей нативного и децеллюляризиро-ванного пищевода по ван Гизону, трихромом по Массону, тропным к соединительнотканным волокнам, в нативной ткани позволила подробнее визуализировать волокна внеклеточного матрикса, их гистоархитектонику и локализацию в пищеводе. Окрашенные соединительнотканные волокна преимущественно локализовались в области базальной мембраны эпителия, в подслизистом, а также в мышечном слоях. В децеллюляризированной ткани внеклеточный матрикс, состоящий преимущественно из коллагена, оставался неизмененным (рис. 4 А-Г). Набухания либо иных патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани обнаружено не было. При окрашивании флуорофором DAPI (4',6-ди-амидино-2-фенилиндолом) в парафиновых срезах нативных органов отмечалось интенсивное свечение ядер, в децеллюляризированных - свечение полностью отсутствовало (рис. 4 Д-Е). Для более полной и всесторонней морфологической характеристики тканевых структур децеллюля-ризированного матрикса проводили измерение его прочностных свойств при помощи механического тестирования. В результате проведения биомеханических испытаний были получены кривые растяжения в координатах напряжение-деформация. Типичные кривые растяжения приведены на рис. 6. Из графика следует, что при данных условиях испытаний нативные и децеллюляризированные образцы имеют близкую прочность, однако различаются по модулю упругости и предельной деформации. Кривые растяжения имеют несколько характерных областей: начальная область до 75% характеризуется невысоким модулем упругости, затем наклон резко увеличивается, и наконец, при напряжении 750 МПа образцы начинают разрушаться. Децел-люляризированные образцы имели более низкое значение модуля упругости, но более высокую разрывную деформацию. Определение остаточного содержания ДНК - важный этап оценки полученного матрикса после проведенной децеллюляризации. Количественный анализ показал, что содержание ДНК в децеллю-ляризированном пищеводе снижалось до 29% (293,59±27,09 нг/мг в нативном пищеводе и 75,49±7,46 нг/мг - в децеллюляризированном). Полученные результаты свидетельствовали об эффективности децеллюляризации, после которой матрикс был в значительной степени (p = 0,0011) очищен от ядерного материала (рис. 5). Обсуждение Имеющийся опыт децеллюляризации пищевода мелких лабораторных животных позволил транслировать данную методику с оптимизацией протокола по времени экспозиции и концентрации децеллюля-ризирующих растворов на наиболее приближенную к клинике модель низших приматов. В ходе проведения децеллюляризации пищевода нами, на основе литературных данных, были выбраны предварительные критерии оценки качества децеллюляризации матриксов, включающие в себя: отсутствие клеток, определяемых различными методами микроскопии; количественный анализ ДНК, указывающий на остатки ядерного материала; биомеханическую прочность матриксов. Децеллюляризация - это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением внеклеточного матрикса (ВКМ) и трехмерности структуры органа [19, 22], с использованием различных методов воздействия на клетки. Подробное рассмотрение данной проблемы показало, что внеклеточные матриксы обладают всеми характеристиками, необходимыми для создания естественного каркаса тканеинженерного органа или ткани [23]. Перспективы применения децюллюляризирован-ных матриксов определяются выработкой специфичных для каждой ткани методов их получения, и является ключевым моментом комплексной их оценки. Именно поэтому так важен подбор правильного протокола децеллюляризации, при котором сводится к минимуму структурное повреждение, даже в пределах родственных видов тканей. Полученные децел-люляризированные каркасы по данным литературы способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, ответное ремоделирование тканей, однако, при этом они не должны содержать продуктов деградации клеток, остатков химических детергентов, которыми их обрабатывали [22, 24]. Для проведения децеллюляризации могут использоваться различные методы: физические, ферментативные и химические [22]. Каждый химический агент воздействует на орган определенным образом. При выборе правильной временной экспозиции детергентов, способа децеллюляризации ткани мы учитывали ее анатомо-гистологические особенности, так как неудачно и неправильно выбранный детергент мог привести к разрушению структуры матрикса и потере его механических и биологических свойств. В данной работе также принималось во внимание, что при выборе детергентно-энзима-тического метода для децеллюляризации органа или ткани химический агент повреждает матрикс в той или иной степени, таким образом, важно было ми-нимализировать последствия. Децеллюляризированные донорские органы не должны содержать клеток, в том числе клеточных компонентов: цитоплазму и ядра. Их присутствие во ВКМ может способствовать нарушению клеточной биосовместимости /n vitro и вызывать побочные реакции в условиях in vivo при последующей рецеллюляризации [24, 25]. Поскольку при методах децеллюляризации невозможно удалить 100% клеток, существуют различные методы количественной оценки оставшихся компонентов клеток, таких как двухцепочечная ДНК, митохондрии или мембран-ассоциированные молекулы, например, фосфолипиды. Пороговая концентрация остаточного клеточного материала в ВКМ, которая может быть достаточной для развития нежелательного эффекта, не была подробно изучена и может изменяться в зависимости от источника ВКМ, типа ткани, в которую он был имплантирован, и иммунной системы реципиента. В настоящее время не определены количественные критерии эффективности децеллюляризации. Анализ современной научной литературы показал, что изучение развития ремоделирующего эффекта и возникновения побочных явлений на клеточном и организменном уровнях, были предложены минимальные критерии для оценки эффективности децеллюляризации [22]. Эти критерии носят феноменологический характер, они были определены на основе многолетнего опыта изучения каркасов тонкой кишки и мочевого пузыря, которые способствовали тканеспецифичному ремоделированию тканей после имплантации. Более поздние работы поставили эти критерии под сомнение, так как менее эффективно децеллюляризированные ткани показывали аналогичные результаты после имплантации при сравнении с эффективно децеллюляризированными тканями. Хотя эти критерии дают много полезной информации, можно утверждать, что они определяют денуклеаризацию тканей, а не децеллюляризацию. Будущие исследования должны расширить знания в этой области, чтобы показать, насколько эффективно клеточно-ассоциированные белки удаляются и какие последствия эти белки оказывают при ответе на имплантацию для расширения нашего понимания адекватности децеллюляризации тканей [26]. Нативный пищевод Рис. 6. Типичные кривые растяжения образцов пищевода вдоль продольной оси е, % При отработке протокола децеллюляризации пищевода низших приматов время экспозиции детергентов и энзимов было увеличено в два раза в сравнении с оригинальным протоколом децеллю-ляризации пищевода крыс [14], так как при меньшем времени воздействия световая микроскопия показывала наличие неразрушенных клеток и клеточных ядер. Увеличение же концентрации децел-люляризирующих растворов напротив приводило к разрушению внеклеточного матрикса с потерей механических свойств, поэтому исходная концентрация изменена не была. С учетом того, что внутриклеточные и мембранные компоненты являются антигенами, которые обладают возможностью инициировать иммунное отторжение при трансплантации [27, 28] был проведен количественный анализ ДНК в тканях, показавший снижение уровня ДНК в четыре раза по сравнению с исходным количеством. Полученные данные механического тестирования образцов нативного и децеллюляризированного пищевода, вероятно, служат доказательством того, что в нативном образце прочные коллагеновые волокна погружены в клеточную матрицу, которая, обеспечивает связанность композиционной системы и придает образцу дополнительную жесткость. Большая деформируемость децеллюляризированных образцов пищевода, скорее всего, обусловлена значительным вкладом пластической деформации, при которой несвязанные коллагеновые волокна в условии отсутствия клеток могут легко выпрямляться и скользить друг относительно друга, обеспечивая высокую разрывную деформацию. Таким образом, несмотря на близкую прочность нативных и децеллюляризи-рованных образцов, имеются различия в разрывной деформации, которая повышается после проведенной децеллюляризации. 14. Sjoqvist S., Jungebluth P., Lim M. L. et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nature communications. 2014; 5: 3562 реконструктивных вмешательствах с высокой степенью риска для пациентов и, как следствие, улучшить прогноз и выживаемость пациентов после операций. При этом разрабатываемые для оценки качества децеллюляризированных матриксов критерии должны быть комплексными и не ограничиваться только параметрами полного удаления клеток, способных вызвать иммунную реакцию отторжения, но и учитывать степень сохранности белков ВКМ, отсутствие токсичности, возможность восстановления биомеханических характеристик, каркас должен не нарушать клеточной адгезии, полностью воссоздавать трехмерную структуру органа, участвовать в клеточной дифференцировке in vivo, стимулировать реваску-ляризацию и реиннервацию после трансплантации. Будущие исследования по децеллюляризации и рецеллюляризации пищевода низших приматов расширят представления о патофизиологических механизмах регенерации органов и тканей.

About the authors

E. A Gubareva

Kuban State Medical University

Krasnodar, Russia

S. Sjoqvist

Karolinska Institute

Stockholm, Sweden

A. S Sotnichenko

Kuban State Medical University

Krasnodar, Russia

Ling Lim Mei

Karolinska Institute

Stockholm, Sweden

N. F Torres

Karolinska Institute

Stockholm, Sweden

K. A Danilenko

Kuban State Medical University

Krasnodar, Russia

S. V Orlov

Research Institute of Medical Primatology of RAMS

Adler, Russia

S. N Chvalun

National Research Centre «Kurchatov Institute»

Moscow, Russia

T. E Grigoriev

National Research Centre «Kurchatov Institute»

Moscow, Russia

S. N Krasheninnikov

National Research Centre «Kurchatov Institute»

Moscow, Russia

VA. A Porhanov

S.V. Ochapovsky Scientific Research Institute - Regional Clinical Hospital №1

Krasnodar, Russia

I. S Polaykov

S.V. Ochapovsky Scientific Research Institute - Regional Clinical Hospital №1

Krasnodar, Russia

E. V Kuevda

Kuban State Medical University

Krasnodar, Russia

I. S Gumenyuk

Kuban State Medical University

Krasnodar, Russia

P. Macchiarini

Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia; Karolinska Institute

Stockholm, Sweden

References

Supplementary files