Effects of platelet factor 4 on morphological and biochemical signs of apoptosis in T-lymphocytes

Full Text

Хемокины (хемотаксические, или хемоаттрактивные, цитокины) представляют собой белки, которые вызывают направленное движение клеток против градиента концентрации хемокина. Воспалительные хемокины стимулируют миграцию лейкоцитов и макрофагов в очаги воспаления, тогда как гомеостатические хемокины контролируют направленную миграцию различных типов клеток в нормальных условиях [1]. Хемокины могут продуцироваться почти всеми ядросодержащими клетками, а также безъядерными клетками, в том числе тромбоцитами. Активированные тромбоциты способны секретировать 3 разновидности хемокинов: NAP-2 (CXCL7), RANTES и фактор 4 тромбоцитов (platelet factor 4, PF4, CXCL4) [2]. PF4 хранится в а-гранулах тромбоцитов и высвобождается в участках воспаления и повреждения [1]. PF4 относится к группе CXC хемо-кинов (они характеризуются наличием одной аминокислоты, X, разделяющей N-концевые цистеины, C) и подгруппе ELR-отрицательных хемокинов (у них отсутствует трипептид ELR, Глу-Лей-Арг, перед первым цистеином). В отличие от других СХС-хемокинов, которые активны преимущественно по отношению к нейтрофилам, PF4 действует на клетки разных типов. Широкий спектр активности PF4 обусловлен его высоким сродством к распространенным в организме отрицательно заряженным веществам, таким, как сульфатированные гликозаминокликаны [3]. PF4 принимает участие в клеточной дифференцировке, разнообразных регуляторных процессах [4] и специфически вовлечен в патогенез ряда иммунных болезней, в частности, индуцированной гепарином тромбоцитопении [5]. В ряде работ была показана антипролиферативная активность хемокина по отношению к эндотелиальным клеткам и фибробластам [6]. Т. Tanaka и соавт. (1997) показали воздействие PF4 на рост клеток, которые демонстрировали замедление опухолевого роста и ассоциированного с опухолью ангиогенеза после трансфекции и последующей экспрессии PF4 [7]. Одним из возможных механизмов влияния PF4 на функции клеток является регуляция апоптоза. В частности, было показано, что PF4 тормозит спонтанный апоптоз моноцитов и индуцирует их дифференциацию в макрофаги [2]. е-mail: litvinov@mail.med.upenn.edu Несмотря на разнообразие публикаций по PF4, физиологическая и патогенетическая роль этого хе-мокина остается во многом не ясной. Одной из наименее понятных функций хемокинов и, в частности, PF4, является их участие в иммунных реакциях и взаимодействие с иммунокомпетентными клетками. В связи с этим, мы исследовали прямое действие PF4 на морфологические и биохимические признаки апоптоза Т-лимфоцитов человека in vitro. Материал и методы Выделение Т-лимфоцитов. Объектом изучения были Т-лимфоциты периферической крови человека, полученные от 45 практически здоровых доноров (средний возраст 28±5 лет). Венозную кровь (8 мл) наслаивали на равный объем фиколла c плотностью р = 1,077 г/см3. Центрифугировали в течение 40 мин в бакет-роторе при 700g и температуре 4°С. Затем отбирали «кольцо» мононуклеарных клеток и отмывали их два раза центрифугированием при 500g в течение 10 мин. Популяция Т-лимфоцитов была получена методом отрицательной иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen, США). К суспензии клеток добавляли 0,4% раствор трипанового синего и подсчитывали количество жизнеспособных клеток, исключивших краситель, в счетной камере под микроскопом. Культивирование Т-лимфоцитов. К осадку Т-лимфоцитов добавляли питательную среду RPMI-1640, содержащую эмбриональную телячью сыворотку (10%), пенициллин (5000 ед./мл), стрептомицин (5000 мкг/мл) и L-глутамин (1%) из расчета, что на 1 лунку необходим 1 мл клеточной суспензии с концентрацией 2х10в/мл. Клетки культивировали в инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, до 24 ч в отсутствие и в присутствии PF4. Препарат PF4 (исходная концентрация 4,2 мг/мл в 0,5 М хлориде натрия) добавляли в начале культивирования в конечных концентрациях 2 мкг/мл или 100 мкг/мл. Трансмиссионная электронная микроскопия T-лимфоцитов. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 700 g и 18°С, полученный осадок Т-лимфоцитов фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида в течение 1-2 ч при 4°С, а затем 1% растворе тетроксида осмия (2 ч). Далее образцы дегидратировали в этаноле с восходящей концентрацией, в ацетоне и окиси пропилена. Материал заливали эпоксидной смолой Эпон-812. Полимеризовали образцы в течение трёх суток при температуре 37°С, 45°С и 60°С. Ультратонкие срезы получали на микротоме «Ultratom III» (LKB, Швеция). Срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Препараты исследовались на электронном микроскопе Hitachi-125 (Япония). Вестерн-блот анализ. Суспензию клеток после культивирования лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 1 об% Тритон Х-100, 0,1% додецилсульфата натрия, 150 мМ NaCl, 200 мМ дитио-треитола в течение 5 мин при 95°С. Затем образцы были охлаждены на льду и обработаны ультразвуком (UP100H, Hielscher, Германия). Полученные клеточные лизаты замораживались, хранились при -20°С и размораживались непосредственно перед электрофорезом. Перед нанесением на гель в образцы добавляли 0,5 мкл 1% бромфенолового синего. Образцы клеточных лизатов, содержащие ~50 мкг белка, были разделены в 4-12% градиенте SDS-PAAG. После окончания электрофореза гель помещали в трансфер-буфер (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, рН 8,3) и переносили белки на нитроцеллюлозную мембрану (Invitrogen, Molecular Probes) в течение 1 ч при напряжении 350 вольт. Для выявления белков использовали первичные мышиные антитела к каспазе-3 человека и антитела кролика к р-актину человека. В качестве вторичных антител использовали моноклональные антитела, коньюгированные с пероксидазой. Полосы на имму-ноблотах визуализировали добавлением хемилюминесцентного субстрата Novex ECL. Результаты Влияние PF4 на ультраструктуру Т-лимфоцитов. Для оценки функциональных эффектов PF4 была изучена ультраструтура Т-лимфоцитов, интактных или обработанных PF4 в концентрации 2 мкг/мл и 100 мкг/мл. Клетки отбирались для исследования через 2, 4, 6, 12 и 24 ч после добавления PF4. 2 ч инкубации. В контрольных образцах (без добавления PF4) в начале (рис. 1A) и после 2 ч культивирования (рис. 1B) клетки имели структуру, характерную для Т-лимфоцитов. Как правило, были отчетливо видны крупное ядро, аппарат Гольджи, митохондрии. Однако, помимо нормальных клеток, были обнаружены лимфоциты со сниженным содержанием митохондрий, что является признаком ста-рения/гибели клеток. Конденсация хроматина в ядре таких клеток также указывала на активацию апо-птотоза. Одновременно было повышено содержание лизосом, характерное для апоптоза. В отличие от интактных клеток (рис. 2А), через 2 ч после добавления к T-лимфоцитам PF4 в конечной концентрации 2 мкг/мл большая часть клеток имела морфологические признаки апоптоза (рис. 2B). Наиболее характерными из них были конденсация хроматина и формирование инвагинаций ядерной мембраны. Количество митохондрий, как и в контрольных образцах, было незначительным. Перечисленные признаки свидетельствуют о ранних этапах апоптоза. Помимо описанных особенностей, для контрольных Т-лимфоцитов и инкубированных с PF4 в концентрации 2 мкг/мл характерны потеря межклеточных контактов и отделение апоптотически измененных клеток от нормальных лимфоцитов. У Т-лимфоцитов, инкубированных с PF4 в концентрации 100 мкг/мл через 2 ч апоптотические проявления отсутствовали и ультраструктура клеток соответствовала нормальной морфологии (рис. 3A, B). Рис. 1. Электронограммы контрольных Т-лимфоцитов до культивирования (А) и после 2 (B), 4 (C), 6 (D), 12 (E) и 24 (F) ч инкубации без добавления PF4. Ув. *10 000 Рис. 2. Электронограммы Т-лимфоцитов до культивирования (А) и после 2 (B), 4 (C), 6 (D), 12 (E) и 24 (F) ч инкубации в присутствии 2 мкг/мл PF4. Ув. *10 000 Рис. 3. Электронограммы Т-лимфоцитов до культивирования (А) и после 2 (B), 4 (C), 6 (D), 12 (E) и 24 (F) ч инкубации в присутствии 100 мкг/мл PF4. Ув. *10 000 Хорошо дифференцировалось крупное ядро округлой формы, занимающее большую часть клетки, с диффузным хроматином. В отличие от других групп клеток, хорошо определялось ядрышко, заполненное базофильным веществом - РНК. Митохондрии, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум были также отчетливо различимы в цитоплазме. Митохондрии имели правильную форму с хорошо дифференцированными кристами. Плазматическая и ядерная мембраны ровные без инвагинаций. Клетки располагались близко друг к другу, сохраняя межклеточные контакты. 4 ч инкубации. Через 4 ч большая часть Т-клеток в контрольном образце находилась в состоянии апоптоза (рис. 1C). Хроматин был конденсирован, но при этом ядерная мембрана была интактна либо образовывала небольшие инвагинации. Плазматическая мембрана становилась асимметричной и формировала небольшие выпячивания. Митохондрии хорошо дифференцировались в цитоплазме, но их число было снижено. Аналогичные признаки наблюдались в Т-лимфоцитах с PF4 в концентрации 2 мкг/мл (рис. 2C). Повышение концентрации хемокина до 100 мкг/мл сокращало проявления апоптоза в клетках (рис. 3C). Лимфоциты данной группы имели овальную форму, число митохондрий было выше по сравнению с другими группами. В цитоплазме были хорошо различимы эндоплазматическая сеть и аппарат Гольджи. Однако, как и в других группах клеток, хроматин был конденсирован по периферии ядра в виде полусфер и глыбок. 6 ч инкубации. Культивирование контрольных клеток в течение 6 ч усугубляло апоптоз. Клетки уменьшались в размерах за счет конденсации цитоплазматических органелл (рис. 1D). Возрастала доля клеток, ядерная мембрана которых имела инвагинации, причем более глубокие по сравнению с 4 ч культивирования. Были обнаружены фрагменты разрушенных клеток - апоптотические тельца, признак заключительной стадии апоптоза. Добавление PF4 в концентрации 2 мкг/мл не оказывало значительного влияния на клетки по сравнению с контролем. Клетки по-прежнему имели овальную форму, но ядерная мембрана формировала инвагинации (рис. 2D). Хроматин конденсировался по периферии ядра в форме глыбок. Плазматическая мембрана имела небольшие выпячивания. Описанные признаки в совокупности указывают на начальную стадию апоптоза. В группе с PF4 в концентрации 100 мкг/мл большая часть клеток имела типичную морфологию Т-лимфоцитов (рис. 3D). Ядро бобовидной формы занимало практически весь объем клетки. Диффузный хроматин был представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухрома-тин). Был хорошо различим ободок перинуклеарного просветления. Кроме того, в отличие от двух других групп, клетки сохраняли межклеточные контакты и располагались плотно друг к другу. 12 ч инкубации. Через 12 ч контрольные клетки были неоднородны (рис. 1E). Некоторые из них имели нормальную ультраструктуру с крупным ядром округлой либо бобовидной формы. Несмотря на наличие ядрышек, хроматин становился конденсированным. Наряду с изменением в ядре, плазматическая мембрана становится асимметричной, формируя инвагинации. Другая часть Т-лимфоцитов, помимо конденсированного хроматина, характеризовалась уменьшением объема ядра и формированием инвагинаций ядерной мембраны, что соответствует апоптотическим изменениям. Схожие морфологические изменения обнаружены в клетках, инкубированных с PF4 в концентрации 2 мкг/мл (рис. 2E). Часть из них имела овальную форму с ровными, без инвагинаций, ядерной и цитоплазматической мембранами (не показано). Ядро имело округлую форму с диффузным хроматином. У другой части клеток, напротив, ядро уменьшалось в объеме и формировало глубокие инвагинации. В цитоплазме были различимы митохондрии, но их содержание было снижено. Мембрана становилась асимметричной и формировала многочисленные изгибы. Ультраструктура Т-клеток, культивируемых с хе-мокином в концентрации 100 мкг/мл в течение 12 ч, свидетельствует об их нормальном функциональном состоянии. Было хорошо видно крупное ядро овальной формы с диффузным хроматином, представленным гетеро- и эухроматином (рис. 3E). Отчетливо различалось ядрышко, заполненное базофильным веществом. Вокруг ядра было различим ободок перинуклеарного просветления. В цитоплазме обнаружены митохондрии, рибосомы и эндоплазматический ретикулум. 24 ч инкубации. К 24 ч количество Т-лимфоцитов в контрольной группе уменьшалось. Большая их часть имела признаки апоптотических изменений на разных стадиях процесса (рис. 1F). В частности, наблюдалась потеря микроворсинок клеточной мембраной. Ядерная мембрана сохраняла целостность и ядро имело округлую форму, однако хроматин был конденсирован по периферии. Отчетливо различался ободок перинуклеарного пространства. Плазматическая мембрана, в отличие от ядерной, формировала инвагинации. Содержание органелл в цитоплазме снижалось, они становились трудноразличимы. Перечисленные признаки соответствуют наиболее ранним стадиям апоптоза. Для другой части клеток контрольной группы были характерны более глубокие ультраструктурные изменения. Плазматическая мембрана теряла симметричность, однако целостность ее не была нарушена. Ядро уменьшалось в объеме, становилоась асимметричным, а его мембрана имела глубокие инвагинации. Подобные изменения ядра свидетельствуют о поздних стадиях апоптоза. Кроме того, на снимках, помимо типичных лимфоцитов, были обнаружены фрагменты мертвых клеток - апоптотические тельца, признак заключительной стадии апоптоза. Т-лимфоциты с PF4 в концентрации 2 мкг/мл после 24 ч характеризовались правильной овальной формой (рис. 2F). Несмотря на сохранность симметрии, плазматическая мембрана формировала небольшие инвагинации. Ядерная мембрана, в отличие от клеточной, имела единичные инвагинации. Хроматин был сконденсирован по периферии ядра в форме глыбок. Перинуклеарное пространство было ярко выражено. Клеточные органеллы (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, вакуоли) были хорошо различимы в цитоплазме. Перечисленные признаки указывают на ранние стадии апоптоза. Клеток с более глубокими апоптотическими изменениями обнаружено не было. В последней исследуемой группе (100 мкг/мл PF4) морфология клеток не была подвержена апо-птотическим изменениям (рис. 3F). Для них была характерна сохранность межклеточных контактов. Ядерная и плазматическая мембрана ровные, правильной округлой формы, инвагинации отсутствовали. Ядро занимало большую часть клетки и, как правило, располагалось центрально. Практически во всех клетках отчетливо определялось ядрышко. Ядерное вещество распределялось равномерно. В цитоплазме были различимы рибосомы, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум и довольно крупные митохондрии, имеющие правильную форму с хорошо дифференцированными кристами. Чаще всего, скопление митохондрий наблюдалось медиально, вблизи ядра. Влияние PF4 на содержание каспазы-3 в Т-лимфоцитах. Биохимическим маркером активации апоптоза в клетках служит протеолитическое расщепление прокаспазы-3 с образованием эффекторной каспазы-3. В апоптотических клетках активная каспаза-3 расщепляет ингибитор ICAD, что высвобождает эндонуклеазу CAD. Активность фермента приводит к деградации хромосомной ДНК, вызывая конденсацию хроматина. Таким образом, повышение содержания каспазы-3 и, соответственно, частичное исчезновение ее неактивной формы - прокаспазы-3 - является показателем интенсивности апоптоза в клетках. Используя вестерн-блот анализ, мы исследовали соотношение каспаза-3/прокаспаза-3 (параметр к) во всех исследуемых группах клеток после 2, 4, 6, 12 и 24 ч культивирования Т-лимфоцитов в отсутствие и в присутствии PF4 (рис. 4). Через 2 ч соотношение каспаза-3/прокаспаза-3 было наибольшим в группе клеток с PF4 в концентрации 2 мкг/мл. При этом соотношение фермент/ профермент было выше 1, что указывает на преобладание активной формы каспазы и активацию апоптоза. В контроле (без PF4) значение к было меньше 1, что говорит о преобладании профермента. Наименьшее значение к было в клетках после инкубации с PF4 в концентрации 100 мкг/мл. р-актин прокаспаза-3 каспаза-3 О 2 100 0 2 100 0 2 100 PF4 (мкг/мл) □ 0 мкг/мл PF4 В 2 мкг/мл PF4 □ 100 мкг/мл PF4 со 1,8 го й 1,5 с о го 1 2 О £-0,9 СО ГО 0,6 о «3 5 о,з СО п Время инкубации, ч Через 4 ч значение к повышалось во всех группах клеток, однако, тенденция к нормализующему влиянию PF4 сохранялась. Так же, как и через 2 ч, наибольшее значение к было выявлено в Т-лимфоцитах с PF4 в концентрации 2 мкг/мл. В контрольных клетках значение к было также выше, однако, сравнивая 2 и 4 ч культивирования, можно заметить почти двукратное увеличение содержания активной каспазы-3 по отношению к проферменту. Увеличение соотношения активной и неактивной форм фермента наблюдается и в клетках с PF4 в концентрации 100 мкг/мл, оставаясь, тем не менее, наименьшим по сравнению с двумя другими группами. Сравнивая содержание каспазы-3 после 6 ч инкубации Т-лимфоцитов с PF4 в концентрациях 2 мкг/мл и 100 мкг/мл, можно заметить, что в обеих группах ее количество снижалось. И только в контрольных клетках значение соотношения каспаза-3/прокаспа-за-3 оставалось повышенным, что указывает на прогрессирование апоптоза. Содержание каспазы-3 продолжало снижаться и после 12 ч культивирования Т-клеток с PF4 в концентрации 100 мкг/мл, тогда как при концентрации PF4 2 мкг/мл соотношение активной и неактивной форм фермента, напротив, повысилось. В контроле количество каспазы-3 по отношению к неактивной форме осталось практически без изменений. К 24 ч культивирования соотношение каспаза-3/ прокаспаза-3 снижалось во всех исследуемых группах, достигая наименьшего значения в клетках с PF4 в концентрации 100 мкг/мл. В Т-лимфоцитах с PF4 в концентрации 2 мкг/мл, несмотря на уменьшение соотношения каспаза-3/прокаспаза-3, количество активной формы оставалось выше, чем неактивной. В контроле содержание двух форм фермента было одинаковым. Обсуждение В представленной работе исследована новая биологическая роль CXC хемокина PF4 как регулятора функционального состояния Т-лимфоцитов. Известно, что быстро индуцируемые реакции Т-клеток, такие как хемотаксис, адгезия и миграция, могут быть опосредованы различными хемокинами, в том числе из группы СХС (фактор стромальных клеток-1, Mig и IP10) [8]. В то же время роль хемокинов в регуляции долгосрочных, «медленных» биологических функций в Т-клетках долгое время оставалась не известной и стала изучаться сравнительно недавно. Рис. 4. Вестерн-блот анализ содержания прокаспазы-3 и ее активной формы каспазы-3 в лизатах Т-лимфоцитов после 2, 4, 6, 12 и 24 ч культивирования в отсутствие и в присутствии PF4: A - контрольные лизаты клеток без PF4 (0 мкг/мл), образцы лизатов, полученных из клеток после инкубации с PF4 в концентрациях 2 мкг/мл и 100 мкг/мл (в качестве «загрузочного» контроля использован в-актин); Б - отношения уровней каспазы-3 и прокаспазы-3 на разных сроках культивирования Т-лимфоцитов в отсутствие PF4 (0 мкг/мл) и в присутствии PF4 в концентрациях 2 мкг/мл и 100 мкг/мл. Содержание каспазы-3 и прокаспазы-3 в разных клеточных лизатах нормализовано по уровню в -актина В нашей работе впервые показана роль PF4 в регуляции апоптоза Т-лимфоцитов периферической крови человека в зависимости от концентрации хемокина во внеклеточной среде. Анти-апоптотический эффект различных веществ, в том числе цитокина IL-7 [9] и фактора SDF-1 [10], был описан ранее, однако роль PF4 как регулятора апоптоза Т-лимфоцитов оставалась не изученной. Сравнительный анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии интактных Т-лимфоцитов и тех же клеток, культивированных в присутствии PF4, обнаружил значительные морфологические отличия, которые сохранялись на протяжении всего периода наблюдения, т. е. до 24 ч. По сравнению с контрольными клетками, наиболее выраженные отличия были обнаружены в препаратах Т-лимфоцитов, культивированных с добавлением PF4 в конечной концентрации 100 мкг/мл. Эти клетки сохраняли морфологию нормальных Т-лимфоцитов на протяжении всего времени культивирования, тогда как контрольные клетки имели структурные признаки прогрессирующего апоптоза. Эти данные подтверждаются результатами исследования биохимического маркера апоптоза - фермента каспазы-3, которые подтверждают, что PF4 в концентрации 100 мкг/мл существенно снижал соотношение акивной каспазы-3 и неактивной прокаспазы 3, т.е. подавлял активность одного из наиболее важных внутриклеточных медиаторов апоптоза. Анализируя изменения уровня каспазы-3, следует учитывать, что культивирование клеток сопровождается снижением количества питательных веществ, что служит стимулом к активации апоптоза. Вероятно, поэтому к 4 ч содержание каспазы-3 во всех клетках стало повышаться, однако в присутствии PF4 уровень каспазы-3, а, значит, и выраженность апоптоза, прогрессивно уменьшались. В отличие от высокой концентрации (100 мкг/мл), присутствие PF4 в низкой концентрации (2 мкг/мл) не оказывало существенного влияния на Т-клетки. Как и в контроле, эти лимфоциты были подвержены апоптотическим изменениям, что проявлялось как морфологически, так и биохимически появлением каспазы-3, количество которой колебалось на протяжении всего времени культивирования. Тем не менее, по сравнению с контрольными образцами, под действием низкой концентрации PF4 снижалась доля клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза, а также количество апоптотических телец, что свидетельствует о слабом нормализующем эффекте хемокина. Полученные результаты указывают на дозо-зависимое анти-апоптотическое влияние PF4 на Т-лимфоциты, которое, скорее всего, обусловлено прямым взаимодействием PF4 с плазматической мембраной клеток. Fleisher и соавт. [11] показали, что низкоаффинное связывание PF4 с рецепторами Т-клеток существенно зависит от концентрации хемокина во внеклеточной среде. В концентрациях до 50 нМ PF4 почти не связывался с поверхностью Т-лимфоцитов, однако взаимодействие возрастало при более высокой концентрации, достигая максимума при 1 мкМ PF4. Эти цифры согласуются с нашими наблюдениями, согласно которым при концентрации PF4 2 мкг/мл (60 нМ) эффект PF4 был не значительным, тогда как в концентрации 100 мкг/мл (3 мкМ) хемокин вызывал отчетливую клеточную реакцию. Вопрос о механизме обнаруженного влияния PF4 на апоптоз Т-лимфоцитов остается открытым, однако есть основания для осторожного предположения. Kasper с соавт. на культуре моноцитов продемонстрировали защитную функцию PF4, который одновременно стимулировал дифференцировку моноцитов в макрофаги [12]. Действие PF4 на клетки протекало при участии тирозинкиназы Syk и протеин киназы PI3K, тогда как PF4-опосредованная защита моноцитов от апоптоза связана с активацией Erk-киназы. Поскольку MAPK-сигнальные пути являются консервативными для всех эукариот и контролируют такие процессы как транскрипция генов, пролиферация и апоптоз клеток, можно предположить, что эти же киназы вовлечены в защитный антиапоптотиче-ской эффект PF4 на Т-лимфоцитах. Таким образом, наши результаты показывают, что PF4, наряду с известным широким спектром биологической активности [13], оказывает анти-апоптотическое действие на Т-лимфоциты. Независимо от механизма этого явления, наши результаты дают основания предполагать, что PF4 может выступать в роли иммуномодулятора. Этот цитокин может стимулировать иммунный ответ, подавляя апоптоз иммунокомпетентных клеток и тем самым продлевая срок их функционирования. Благодарности Авторы благодарны д-ру Любике Рауовой (Dr. Lubica Rauova) из Детской больницы Филадельфии (США) за любезно предоставленный препарат рекомбинантного очищенного PF4. Авторы также выражают благодарность Анастасии Пономаревой (Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН) за помощь в подготовке ультратонких срезов для трансмиссионной электронной микроскопии. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

About the authors

Y. V Skibo

Kazan (Volga region) Federal University

A. R Fathullina

Kazan (Volga region) Federal University

E. V Romanova

Kazan (Volga region) Federal University

R. I Litvinov

Kazan (Volga region) Federal University; University of Pennsylvania School of Medicine

References

Supplementary files