Investigation of recombinant therapeutic genes expression in umbilical cord blood mononuclear cells transduced with three adenoviral vectors encoding neurotrophic factors GDNF, VEGF and neural cell adhesion molecule NCAM

Full Text

Развитие регенеративной медицины базируется на современных технологиях генной, клеточной и тканевой инженерии. Одним из перспективных направлений регенеративной медицины является создание лекарственных препаратов нового поколения, содержащих рекомбинантные гены [1]. Такие препараты могут применяться как для прямой генной терапии, так и для генной терапии на клеточных носителях. Клонированные гены, кодирующие молекулы иммунной защиты, апоптоза, трофические факторы и др. применяются в клинических испытаниях терапии моногенных, сердечно-сосудистых, неврологических заболеваний, при онкологических состояниях. Для клеточно-опосредованной терапии используют разные типы клеточных носителей. Наиболее часто для этой цели применяют стволовые мезенхимные клетки из красного костного мозга и мононуклеарные клетки из крови пуповины (МКПК) [2]. Доставку терапевтического гена в клетки осуществляют с помощью плазмидных или вирусных векторов. Плазмидные векторы поддерживают кратковременную (недели) сверхэкспрессию целевого гена, тогда как вирусные могут обеспечивать экспрессию терапевтического гена месяцы и годы [3]. е-mail: slamru@yahoo.com Выбор вектора и клеточного носителя определяется конкретными терапевтическими задачами. Целью наших исследований является создание генно-клеточного лекарственного препарата для стимуляции нейрорегенерации после травмы, ишемического инсульта и при нейродегенеративных заболеваниях. Ранее нами были получены генно-клеточные конструкции на основе мононуклеарной фракции пуповинной крови и двухкассетного плазмидного вектора, одновременно кодирующего два терапевтических гена [4, 5]. Конкретной задачей настоящего исследования является создание генно-клеточного лекарственного препарата на основе МКПК и трех аденовирусных векторов, экспрессирующих рекомбинантные гены глиального нейротрофического фактора (GDNF), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и молекулы нейрональной адгезии (NCAM). Предполагается, что доставка именно этой комбинации терапевтических генов будет наиболее эффективно способствовать преодолению последствий нейродегенерации и стимулировать нейрорегенерацию в ЦНС. Иммуноэкспрессия терапевтических генов была изучена in vivo, после ксенотрансплантации трансдуцированных МКПК трансгенным G93A мышам с моделью нейродегенеративного заболевания бокового амиотрофического склероза. материал и методы Выделение МКПК в градиенте плотности фиколла Выделение МКПК проводили в пробирках объемом 50 мл, согласно опубликованной ранее методике [6]. В каждую пробирку вносили по 25 мл раствора фиколла плотностью 1,077 г/мл (ПанЭко, Россия), на который аккуратно при помощи автоматического дозатора наслаивали равный объем пуповинной крови с антикоагулянтом (соотношение крови и антикоагулянта колебалось в пределах Проводили центрифугирование при 720 g в течение 20 мин и получали четкое разделение крови на 4 фракции: эритроциты, фиколл, лейкоциты и плазму. Лейкоцитарную фракцию собирали в отдельную пробирку, ресуспендировали в растворе фосфатно-солевого буфера, модифицированного Дульбекко (DPBS) (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:2 и центрифугировали при 305g в течение 15 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл раствора DPBS и повторно центрифугировали при 305 g в течение 15 мин. Для удаления эритроцитов клетки ресуспендировали в гипотоническом лизирующем буфере (0,168 M NH4Cl, 0,1 M KHCO3, 1,27 мМ EDTA, pH 7,3), на заключительном этапе клетки отмывали раствором DPBS. МКПК человека после выделения поддерживали на среде RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 1 мМ L-глутамина, 10% сыворотки крови плодов коров и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл; 100 мкг/мл) (Sigma, США). Генетическая модификация МКПК человека рекомбинантными аденовирусами Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1 Непосредственно после выделения мононуклеарные клетки высевали на 6 см культуральный планшет из расчета 2 млн кл./лунка и трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами [7, 8]. При ко-трансдукции тремя аденовирусами Ad5-GDNF, Ad5-VEGF165, Ad5-NCAM1 МКПК общий показатель «множественность инфицирования» (multiplicity of infection, MOI) был равен 10. Клетки выдерживали во влажной среде при температуре +37°С с 5% содержанием CO2. Через 96 ч после инфицирования клетки снимали с планшета и анализировали экспрессию мРНК VEGF165, GDNF, NCAM1 методом ПЦР-РВ. Для ксенотрансплантации трансгенным животным, экспрессирующим фенотип бокового амиотрофического склероза, трансдуцированные МКПК собирали через 16 ч путем центрифугирования при 500g в течение 5 мин. Клеточный осадок трижды промывали в растворе DPBS, после чего растворяли в стерильном растворе 0,9% хлорида натрия из расчета 2х10в клеток в 100 мкл инъекции. Оценка экспрессии мРНК рекомбинантных генов vegf165, gdnf и ncam1 в МКПК Выделение тотальной РНК из модифицированных и нативных МКПК проводили с помощью набора Yellow solve (Силекс, Россия), согласно инструкциям производителя. Для синтеза кДНК использовали 150 нг РНК-матрицы. Реакцию обратной транскрипции проводили на приборе С1000 (BioRad). Реакционная смесь общим объемом 12,5 мкл содержала 150 нг РНК, 50 нм гексануклеотидного random-праймера и деионизированную воду. Первоначально проводили предварительный нагрев в течение 5 мин при 65°С. Далее в каждый исследуемый образец добавляли по 4 мкл 5Х буфера для обратной транскриптазы, 20U ингибитора РНаз Ribolock RNAse inhibitor (Thermoscientific), 1 мМ дНТФ, 200 U обратной транскриптазы Revertaid Reverse Transcriptase (Thermoscientific). Синтез кДНК проводили при следующих параметрах реакции: 25°С 10 мин, 42°С 60 мин, 70°С 10 мин. Количественную оценку транскрипции мРНК генов vegf165, gdnf, ncam1 в МКПК проводили методом ПЦР-РВ на приборе CFX96 Real-Time System (BioRad) c использованием программного обеспечения BioRad CFX Manager и пакета программ MS Excel. ПЦР-РВ проводили по методике гидролизуемых проб (TaqMan) c использованием геноспецифичных ДНК-зондов. Нуклеотидные последовательности праймеров и проб представлены в таблице 1. Таблица 1. нуклеотидные последовательности праймеров и днк-зондов для пцр-рв Название праймера Нуклеотидная последовательность VEGF-TM-Forward ATCACCATGCAGATTATGCG VEGF-TM-Reverse TGCATTCACATTTGTTGTGC VEGF-TM-Probe [FAM]TCAAACCTCACCAAGGCCAGCA[BHQ1] GDNF-TM-Forward CGCTGAGCAGTGACTCAAAT GDNF-TM-Reverse CGATTCCGCTCTCTTCTAGG GDNF-TM-Probe [FAM]TCCATGACATCATCGAACTGATCAGG[BHQ1] 18S-TM-Forward GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG 18S-TM-Reverse CATTCTTGGCAAATGCTTTCG 18S-TM-Probe [HEX]ACCGCGCAAGACGGACCAG[BHQ2] NCAM1-TM-Forward AGATGAGGGCACTTATCGCT NCAM1-TM-Reverse GATGGTAGGTGGCACATTCA NCAM1-TM-Probe [FAM]CCGTGCCAGGATTCTGCCCT[BHQ1] Компоненты реакции для проведения ПЦР-РВ (15 мкл): 0,5 pl ДНК-матрицы, 2,5Х реакционная смесь Б (Синтол), 200 нМ прямого и обратного праймера и 100 нМ флуоресцентной пробы (табл. 1). Амплификацию проводили при режиме: 95°C 3 мин, 39 циклов: 95°C 10 с, 55°C 15 с, включая сканирование планшета. Количество мРНК было нормализовано по гену «домашнего хозяйства» 18S рРНК. Для построения стандартных кривых и оценки относительной экспрессии рекомбинатных генов, кодирующих NCAM1, VEGF и GDNF, использовали серийные разведения плазмидной ДНК со вставками целевых генов. Уровень экспрессии генов в нетрансдуциро-ванных МКПК принимали за 100%. ПЦР-РВ ставили в трех повторностях. Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ MS Excel 2007. Для оценки достоверности полученных результатов использовали t-тест Стьюдента с уровнем значимости менее 1% (р<0,01). Ксенотрансплантация МКПК, сверэкспрессирующих рекомбинантные гены vegf165, gdnf и ncam1, в спинной мозг трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза Доклинические испытания полученного генноклеточного лекарственного препарата были проведены на трансгенных мышах B6SJL-Tg(SOD1-G93A) dl1Gur/J, приобретенных из питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН). Данная линия мышей характеризуется присутствием в геноме аллелей мутантного гена человека - Cu/Zn-супероксиддисмутазы sod1 (глицин замещен на аланин в позиции 93), в результате чего у мышей развивается заболевание, напоминающее боковой амиотрофический склероз человека. В виварии Казанского государственного медицинского университета половозрелые мыши в возрасте 26 нед. (до проявления клинических признаков заболевания) были отобраны для трансплантации МКПК, трансдуцированных Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad-NCAM1. Трансплантацию клеток выполняли путем интраспинальной инъекции 1х10в МКПК в 5 мкл DPBS (БиолоТ, Россия) в поясничный отдел спинного мозга подопытных животных. Через 2 нед. после трансплантации мышей наркотизировали, через большой круг кровообращения транскардиально перфузировали сначала холодным фосфатно-солевым (ФС) буфером (Биолот), затем - холодным 4% раствором параформальдегида на ФС буфере. Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, в течение 12 ч фиксировали в растворе параформальдегида, после чего, в целях криопротекции, фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы (Хеликон, Россия), приготовленным на ФС буфере с добавлением азида натрия (Sigma, США). Все процедуры с животными проведены в соответствии с решением этического комитета Казанского государственного медицинского университет (№5 от 27.05.2014). Иммунофлуоресцентный метод Продукт экспрессии рекомбинантных генов (VEGF, GDNF, NCAM) выявляли с помощью тройного иммунофлуоресцентного окрашивания поперечных срезов спинного мозга. МКПК идентифицировали по иммуноэкспрессии человеческого ядерного АГ. Замороженные срезы толщиной 20 мкм готовили на криостате HM560 Cryo-Star (CarlZeiss). После промывки срезов в ФС буфере неспецифические места связывания блокировали в ФС буфере, содержащем 0,1% Тритон X-100 и 5% сыворотку осла (Jackson ImmunoResearch lab., США), в течение 45 мин при комнатной температуре. Для идентификации АГ срезы инкубировали с первичными АТ к HNA, VEGF и GDNF (табл. 2) в течение 1 сут. при 4°C, затем промывали в ФС буфере и инкубировали со вторичными АТ осла, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 488 и Alexa 647 (разведение 1:250) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки в ФС буфере проводили инкубацию АТ к NCAM, конъюгированным с флуоресцентным красителем PE (фикоэритрин). Для визуализации клеточных ядер срезы дополнительно окрашивали в течение 10 мин. при комнатной температуре раствором4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, Sigma, США). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 780-Meta (Carl Zeiss, Германия). Таблица 2. первичные антитела для иммунофлуоресцентного окрашивания Антиген Антитела Разведение Производитель HNA (ядерный антиген человека) Мышь, моноклональные 1:100 Chemicon, США VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста) Кролик, поликлональные 1:150 Santa Cruze, США GDNF (глиальный нейротрофический фактор) Кролик, поликлональные 1:150 Santa Cruze, США NCAM (CD56-PE) (молекула нейрональной адгезии) Мышь, моноклональные 1:100 Сорбент, Россия результаты Экспрессия рекомбинантных терапевтических генов в МКПК in vitro На гистограмме (рис. 1) представлены данные, полученные в ходе трех независимых экспериментов. Через 96 ч после трансдукции МКПК собирали с культурального планшета и анализировали относительное содержание мРНК генов vegf165, gdnf и ncam1 методом ПЦР-РВ. Было показано, что при ко-трансдукции двумя рекомбинантными генами эффективность их экспрессии увеличилась в 200 и 140 раз, соответственно. При одновременной генетической модификации тремя аденовирусными векторами показатели относительной экспрессии для каждого гена колебались в пределах 50-90 раз по сравнению с нетрансдуцированным контролем. VEGF NCAM1 GDNF Рис. 1. Содержание мРНК генов vegf165, gdnf, ncam1 в МКПК через 96 ч после трансдукции аденовирусами Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1. ПЦР-РВ, нормализация по гену 18S рРНК Иммуноэкспрессия VEGF, GDNF и NCAM в модифицированных МКПК человека после трансплантации в спинной мозг трансгенных G93A мышей Для идентификации VEGF, GDNF и NCAM в МКПК было проведено тройное иммунофлуоресцентное окрашивание поперечных срезов спинного мозга мышей с помощью АТ в комбинациях: 1) против ядерного АГ человека (HNA), GDNF и NCAM; 2) HNA, VEGF и NCAM. Через две недели после трансплантации в спинном мозге подопытных мышей были обнаружены HNA-позитивные клетки. Преимущественно клетки локализовались в месте инъекции, однако МКПК были выявлены и на удалении, что свидетельствует об их миграционном потенциале. С помощью тройного иммунофлуоресцентного окрашивания были выявлены МКПК, экспрессирующие терапевтические гены GDNF, VEGF и NCAM (рис. 2). обсуждение Ранее для стимулирования нейрорегенерации нами были получены и испытаны генно-клеточные конструкции на основе МКПК и двухкассетных плаз-мидных векторов. Впервые нами было показано, что МКПК, трансфицированные плазмидным вектором pBud-VEGF-L1CAM и введенные ретроорбитально 22-25-недельным трансгенным G93A мышам выживали более 4 нед. и дифференцировались в эндотелиальные клетки и клетки микроглии [4, 5]. В следующей своей работе мы установили, что МКПК, трансфицированные двухкассетным плаз-мидным вектором pBud-VEGF-FGF2 могут дифференцироваться в SIOO-позитивные клетки [9]. Таким образом, полученные нами результаты по трансплантации МКПК, трансфицированных плаз-мидными векторами, трансгенным G93A мышам свидетельствуют о том, что инъецированные в кровь клетки мигрируют через гематоэнцефалический барьер в паренхиму спинного мозга, длительно сохраняют жизнеспособность и, в зависимости от типа экспрессионного вектора, могут дифференцироваться в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты. На данном этапе мы рассматривали МКПК как источник новых паренхиматозных клеток спинного мозга. Недавно было установлено, что мезенхимные стволовые клетки человека, одновременно сверх-экспрессирующие рекомбинантные гены gdnf и vegf, при внутримышечной инъекции крысам с моделью бокового амиотрофического склероза поддерживают структуру нервно-мышечного синапса и продлевают жизнь животных, по-видимому, за счет сверх-продукции рекомбинантных нейротрофических факторов [10]. Исходя из вышеизложенного в настоящем исследовании нами был получен новый генно-клеточный препарат на основе МКПК и трех аденовирусных векторов, кодирующих нейротрофические молекулы (VEGF и GDNF) и молекулу нейрональной адгезии (NCAM). По нашим представлениям, трансдуцированные МКПК за счет синергичной сверх-продукции VEGF и GDNF могут иметь более выраженный эффект на выживание нервных клеток в очаге нейродегенерации. Трансдукция мононуклеарных клеток вирусом, экспрессирующим NCAM, позволит повысить их выживаемость, хоминг и миграцию в паренхиму мозга. Исследования с применением указанной комбинации генов для трансдукции Рис. 2. Трансдуцированные МКПК человека в поясничном отделе спинного мозга B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J трансгенных мышей на расстоянии 5 мм в ростральном направлении от места инъекции через 14 сут. после трансплантации. Верхняя панель - экспрессия HNA, GDNF и NCAM; нижняя панель - экспрессия HNA, VEGF и NCAM. Иммуногистохимиечская реакция. Флуоресцентная микроскопия. Шкала - 5 мкм мононуклеаров крови пуповины и их трансплантации с целью стимулирования нейрорегенерации после нейротравмы, ишемического инсульта и при нейродегенеративных заболеваниях представляется перспективным направлением в создании лекарственных препаратов, содержащих клонированные гены, и для развития регенеративной медицины в целом. благодарности Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 14-15-00847, совместным грантом РФФИ и Академии наук РТ № 13-04-97156, а также грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук МД-433.2013.4. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

About the authors

R. R Islamov

Kazan State Medical University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

E. E Cherenkova

Kazan (Volga region) Federal University

Y. O Mukhamedshina

Kazan State Medical University

I. I Salafutdinov

Kazan State Medical University

Z. Z Safiullov

Kazan State Medical University

A. A Izmailov

Kazan State Medical University

M. A Mukhamedyarov

Kazan State Medical University

D. S Guseva

Kazan State Medical University

References

Supplementary files