The Use of Cord Blood Stem Cells in Clinical Practice

详细

Here we review general achievements in cord blood (as well as the cord) stem cells use. In two main part of the review we discuss the clinical experience of progenitors from cord blood in treatment of oncology and other diseases.

The major results of clinical trials in children and adult patients are briefly presented in several tables. Besides, there are two parts dedicated to some difficulties and problems, connected with the use of cord blood stem cells and to general perspective trends ofcord blood cells clinical use.

全文:

Первая трансплантация клеток пуповинной крови [ПК] была проведена в 1988 году пациенту с анемией Фанкони [1]. По разным данным, в период с 1993 по 2007 год было выполнено 8000-9000 трансплантаций ПК. Общее количество замороженных образцов составляет 350-400 тысяч по всему миру [2]. Их количество с каждым годом растет, это связано со следующими факторами:

• появляются новые подтверждения преимущества неродственной трансплантации клеток ПК по сравнению с клетками костного мозга [КМ];
• улучшается долговременный прогноз после использования клеток ПК;
• низкое число клеток в образце ПК преодолевается при помощи трансплантации двух образцов ПК или экспансии клеток in vitro;
• увеличивается общее количество банкированных образцов;
• улучшаются условия логистики и общей доступности образцов.

По количеству ежегодных трансплантаций ПК лидирует Япония, затем идут США, где половина трансплантаций у детей приходится на ПК, а у взрослых пациентов этот показатель достигает 20% [2]. Однако до 40% смертности после пересадки клеток ПК все еще связано с инфекционными заболеваниями, как и при любом другом типе гемотрансфузии [3]. Кроме того, существует информация, свидетельствующая о том, что критическая доза клеток, меньше которой, смертность значительно возрастает, составляет 1,7х10⁵ СD34⁺/кг [4]. На момент написания обзора количество клинических исследований [в фазе набора испытуемых пациентов], проводимых с использованием ПК, только в США составляло 150 [5].

1. Гематологические заболевания

Область применения клеток ПК в гематологии - наиболее широкая, по сравнению с другими областями медицины. В этом случае о ПК говорят прежде всего как об источнике гемопоэтических клеток. Одной из наиболее многообещающих и молодых методик является пересадка двух частичнородственных образцов ПК. Эта методика уже находится в 3-й фазе клинических испытаний. Показано, что данная практика приводит к ускоренному восстановлению количества нейтрофилов [в среднем - 24 дня] после миелоабляции, а приживление [энграфтмент] составляет 90% [у взрослых]. Этот результат повторяет эффективность применения у детей. Несмотря на то, что механизм действия и относительный вклад как подготовительной терапии флюдарабином [Fludarabine], так и влияние двойной дозы ПК неясно и для его понимания требуется более глубокий анализ, сочетание этих двух факторов обеспечивает стабильный положительный эффект при неродственной трансплантации у взрослых. Другой перспективной методикой, позволяющей достаточно быстро добиться восстановления числа нейтрофилов, является совместная пересадка частично HLA-совпадающих стволовых клеток ПК без Т-клеток [после Т-клеточной деплеции], это обеспечивает быстрое [10 дней], но временное восстановление нейтрофилов. Несмотря на это, такая методика может служить «мостом» и к достижению долговременного эффекта.

Еще одним способом применения ПК, проходящим первые клинические испытания, является трансфузия клеток ПК непосредственно в костный мозг. Это может позволить сократить потери клеток при внутривенной трансплантации, т.к. известно, что значительное количество этих клеток оказывается в паренхиматозных органах [легкие, печень] [6]. Другие методики включают совместную трансфузию Т-клеток [CD4⁺CD25⁺] и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [ММСК], т.к., по предварительным данным, эти клетки обеспечивают иммуносупрессию и способствуют лучшему приживлению трансплантата, а также поддерживают гемопоэз, синтезируя факторы роста и формируя межклеточные контакты, обеспечивая гемопоэтические стволовые клетки [ГСК] нишей [7].

1.1. Неродственная пересадка

Первая неродственная трансплантация клеток ПК была проведена в 1993 году J. Kurtzberg в Duke University. Пациенту в возрасте 20 месяцев с острым лейкозом была проведена трансплантация клеток ПК. Сейчас этот пациент здоров и является наиболее долгоживущим пациентом после трансплантации ПК [8]. Также было отмечено, что при частичном несовпадении HLA5/6 при достаточном количестве клеток удается добиться результатов, аналогичных тем, что наблюдаются при трансплантации полностью совместимых клеток [6/6] [9]. В 2005 году правительство США утвердило бюджет на создание «Изобретений в области пуповинной крови» [National Cord Blood Inventory] в размере 80 млн долларов на следующие 5 лет [«Акт о терапии и исследовании в области стволовых клеток 2005», «Stem Cell Therapeutic and Research Act of 2005»]. Основные результаты неродственных пересадоку детей приведены в таблице 1 [цит. по Ballen К.К. New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood 2005;105: 3786-92].

Таблица 1. Основные результаты неродственных трансплантаций клеток ПК у детей

Опубликовано	Кол-во пациентов	Заболевание	Среднее время наблюдения	Уровень выживаемости в отсутствие проявлений симптомов заболевания
Kurtzberg J. et al., 1994	25	ОЛЛ, ОМЛ, МДС	13 мес.	48%
Locatelli F. et al. 2005	60	ОЛЛ, ОМЛ	14 мес.	34%
Gluckman E. et al., 2006	65	ОЛЛ, ОМЛ, МДС, ХМЛ, лимфома, анемия Фанкони, метаболические нарушения	10 мес.	29%
Wagner J. et al. 2006	102	ОЛЛ, ОМЛ, ХМЛ, лимфома, анемия Фанкони, метаболические нарушения	32 мес.	47%
Michel G. et al. 2003	95	ОМЛ	31 мес.	41%
Staba S. et al. 2004	20	Синдром Гурлера (мукополисахаридоз типа I)	30 мес.	85%

Примечание: ОЛЛ - острый лимфолейкоз; ОМЛ - острый миелолейкоз; МДС - миелодиспластический синдром; ХМЛ - хронический миелолейкоз.

1.1.1. Злокачественные заболевания

Острые лейкозы

Данное заболевание у детей чаще всего требует аллогенной пересадки ГСК. Последние исследования показывают, что через 1 год после трансплантации уровень выживаемости пациентов составляет 59%, а через два года - 47%

[10]. При этом было подсчитано, что среднее количество клеток составило 6-8х10⁷/кг, а уровень восстановления нейтрофилов составил 81%. Однако стоит отметить, что уровень выживаемости в значительной степени зависел от возраста пациента.

Результаты по применению клеток на более взрослых пациентах выглядят значительно скромнее. Кроме того, результаты в этой группе значительно более разнородные. Одна исследовательская группа заявляет 22-25%-ный уровень выживания для пациентов с вторичным лейкозом [11]. Это исследование включает данные собранные из нескольких клинических центров.

V. Rocha и Е. Gluckman [2006] провели ретроспективное исследование, сравнивая результаты после пересадки клеток ПК и гаплоидентичных ГСК [без Т-клеток] [3, 12]. У реципиентов гаплоидентичных ГСК был значительно снижен риск развития реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ], однако через 2 года общая смертность в обеих группах становилась одинаковой. У пациентов с острой миелоидной лейкемией также не наблюдалось развития рецидивов в течение 2 лет после трансплантации, вне зависимости от источника ГСК.

В целом, ПК можно рассматривать как полностью закономерный и обоснованный источник ГСК для пациентов с острой лейкемией, нуждающихся в аллогенной трансплантации.

Хронический миелолейкоз [ХМЛ]

Исследований по лечению хронического миелоидного лейкоза с применением клеток ПК гораздо меньше, по сравнению со всеми остальными заболеваниям. Так, Р. Rubinstein с соавт. указывает на 20%-ю выживаемость после неродственной трансплантации при ХМЛ [13]. При этом уровень рецидивов составил от 10 до 20%, что значительно отличалось от такового при использовании клеток КМ без Т-лимфоцитов.

Миелодиспластический синдром

Редкие работы отдельно посвящены применению клеток ПК при лечении миелодиспластического синдрома, чаще всего исследователи указывают на значительный разброс цифр выживаемости пациентов через 2 года после пересадки - от 25% до 75% [14].

Лимфомы

В случае с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами применение клеток ПК чаще всего описано уже после трансплантации ГСК КМ. Таким образом, значительная часть этих пациентов уже получала сниженные дозы лекарств или немиелоаблативный режим кондиционирования. Клиническое исследование на 21 пациенте свидетельствует в пользу 20-25%-й выживаемости пациентов через год после трансплантации [15].

В исследовании из University of Minnesota, включавшем 110 пациентов после немиелоаблативного кондиционирования, было показано что при дозе 3,0х10⁷ мононуклеарных клеток на кг веса пациента через 3 года после трансплантации процент выживаемости не превышал 45%, при этом развитие острой РТПХ и процент смертности, связанный с трансплантацией составил 26%. Факторы, способствовавшие положительному исходу: отсутствие грибковых инфекций, использование двух образцов ПК и отсутствие острой РТПХ. Все это позволяет применять клетки ПК после немиелоаблативной терапии у взрослых с гематологическими заболеваниями [16].

Таким образом, несмотря на небольшие выборки пациентов, ПК необходимо уже сейчас рассматривать как адекватный источник ГСК для тех, кому требуется неродственная пересадка. Однако, нельзя не отметить более частое развитие РТПХ у взрослых, что, возможно, является результатом инволюции тимуса и не связано напрямую с пересадкой клеток. Основные результаты неродственных пересадок у взрослых приведены в таблице 2 [цит. по Ballen К.К. New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood 2005; 105: 3786-92].

Таблица 2. Результаты применения единственного образца ПК у взрослых пациентах

Опубликовано	Кол-во пациентов	Заболевание	Среднее время наблюдения	Уровень выживаемости в отсутствие проявлений симптомов заболевания
Laughlin M.J. et al. 2003	68	ХМЛ, ОМЛ, ХЛЛ, ОЛЛ, лимфома	22 мес.	26%
Long J. et al. 2005	57	ХМЛ, ОМЛ, ХЛЛ, ОЛЛ, лимфома	56 мес.	19%
Sanz G. et al. 2006	22	ХМЛ, ОМЛ, МДС, ОЛЛ	8 мес.	53%
Ooi J. et al. 2004	18	ОМЛ	18 мес.	76%
Laughlin M.J. et al. 2005	116	ХМЛ, ОМЛ, МДС, ОЛЛ	40 мес.	23%
Rocha V. et al. 2006	98	ОЛЛ, ОМЛ	27 мес.	33%

Примечание: ОЛП - острый лимфолейкоз; ОМЛ - острый миелолейкоз; МДС - миелодиспластический синдром; ХМЛ - хронический миелолейкоз; ХЛЛ - хронический лимфолейкоз.

1.1.2. «Незлокачественные» заболевания

Применение клеток ПК при различных незлокачетсвенных заболеваниях относится, прежде всего, к педиатрической практике. У взрослых подобные процедуры были описаны лишь для больных с приобретенной апластической анемией [17].

Гемоглобинопатии

В целом, сообщения, касающиеся применения клеток ПК при гемоглобинопатиях [серповидно-клеточная анемия и ß-талассемия], носят оптимистический характер. У пациентов с подобными заболеваниями ярче выражено приживление трансплантата, а, значит, и общий уровень выживания после лечения гораздо выше. При достаточном количестве клеток и наличии максимального совпадения реципиента и донора по HLA - антигенам возможно значительное улучшение показателей после трансплантации клеток ПК у больных незлокачественными заболеваниями [18, 19]. Однако, при анализе результатов лечения пациентов в 4-х американских центрах были сделаны следующие выводы [18]. После того, как семи пациентам была проведена неродственная пересадка клеток ПК, оказалось, что после миелоабляции четырем из них - у двух пациентов развилась РТПХ, один пациент умер, у другого развилась хроническая РТПХ. Трансплантат прижился в трех случаях, лишь в одном случае был подтвержден химеризм. У трех других пациентов был проведен режим кондиционирования пониженной интенсивности. У всех трех человек не было зафиксировано приживления [энграфтмента]. Лишь у одного пациента было обнаружено приживление после второй пересадки. Кроме того, у четырех пациентов были обнаружены вирусные инфекции.

При достаточном количестве клеток и наличии максимального совпадения реципиента и донора по HLA - антигенам возможно значительное улучшение показателей после трансплантации клеток ПК у больных «незлокачественными» заболеваниями [19].

Врожденные нарушения метаболизма

Использование аллогенной трансплантации у детей с врожденными метаболическими нарушениями открыло новые возможности лечения этих заболеваний. Успех этого лечения в значительной степени будет зависеть от способности клеток приживаться в организме реципиента, а также от их способности продуцировать необходимые уровни неправильного или отсутствующего фермента. В этих случаях также критичны сроки трансплантации. Например, у пациентов с болезнью Краббе прогноз сомнительный при обнаружении симптомов уже в младенческом возрасте, однако, при пренатальной и срочной постнатальной диагностике и последующей трансплантации ГСК прогноз значительно улучшается [20]. Кроме того, S.L. Staba и соавт. [2004] отметили эффективность использования клеток ПК при синдроме Гурлера [Hurler syndrome, мукополисахаридоз типа I - обусловлен отсутствием фермента a-L-идуронидазы, в результате чего в соединительной ткани органов накапливается дерматансульфат и гепарансульфат], а также при скорейшем использовании клеток от неродственных доноров [21]. Общее исследование эффективности применения клеток ПК при лизосомных и пероксисомных болезнях накопления подтвердило восстановление нейтрофилов у 84% пациентов, а также выживаемость через год после процедуры - 72% [22].

Иммунодефицитные состояния

Известно, что врожденные иммунодефицитные состояния также поддаются коррекции с помощью клеток ПК [23, 24]. Например, пересадка ГСК ПК у больных с синдромом Вискотта-Олдрича приводила к высокой степени приживления трансплантата и общему уровню выживаемости пациентов, также, как и при трансплантации совпадающих по HLA родственных и неродственных клеток КМ [25]. Другие авторы предлагают использовать клетки ПК при лечении синдрома Вискотта-Олдрича из-за их быстрой доступности и меньшей вероятности вызывать РТПХ. Так, сразу после диагностики этого заболевания был использован образец неродственной ПК у двухмесячного пациента [25]. Общее количество мононуклеарных клеток составило 11,14х10⁷/кг. На 80-й день было зафиксировано полное восстановление нормального количества нейтрофилов и тромбоцитов. Это доказываеттот факт, что трансплантация клетокПК в таких случаях является безопасным [а также технически возможным и воспроизводимым] и надежным способом коррекции иммунодефицитных состояний у детей, когда нет возможности провести родственную или неродственную пересадку клеток КМ.

В целом, темпы приживления неродственного частично совпадающего по антигенам HLA трансплантата ПК ниже, чем у клеток КМ, однако в тоже время, развитие РТПХ при этом происходит реже. Общий процент выживающих пациентов практически одинаков для обоих источников клеток. Следует упомянуть, что успех трансплантации во многом зависит и от возраста реципиента. Связь уровня приживления клеток и возраста пациентов представлена в таблице 3 [цит. по Brunstein C.G., SetubaH D. С., Wagner J. E. Expanding the role of umbilical cord blood transplantation. Br. J. Haematol. 2007; 137: 20-35].

Таблица 3. Уровни приживления трансплантатов и уровни выживаемости при различных возрастах реципиентов

Заболевание и возраст	Уровень приживления клеток	Уровень выживаемости пациентов
Новорожденные с лейкозом	80%	55%
Дети с лейкозом	75%	49%
Взрослые с лейкозом	28-48%	75%
Пациенты всех возрастов с незлокачественными заболеваниями	70-80%	80%

 

1.1.3. Первый пример аутогенной трансплантации ПК

Данный опыт описан совместно двумя американскими клиниками: Mayo Clinic, Рочестер, Миннесота и CorCell Inc, Филадельфия, Пенсильвания [26]. Трехлетней пациентке с острым лимфобластным лейкозом был проведен курс химиотерапии через 10 месяцев после постановки диагноза. Вскоре у нее развилось поражение ЦНС. Клиницистам удалось добиться вторичной ремиссии после повторного курса химиотерапии. Затем ей провели курс миелоаблативной терапии и радиотерапии, после чего провели трансфузию клеток ее собственной ПК, сохраненной при рождении. Через 20 месяцев клиницисты констатировали полную ремиссию.

Через 23 часа после получения материала кровь была заморожена в частном банке. Для определения, не присутствует ли лейкозный клон в замороженном образце, был проведен молекулярный анализ [специфические перестановки в генах рецептора ІgН и рецептора T-γJg], обнаруженные в клетках КМ ребенка. Общее количество клеток в образце после размораживания составило 54х10⁶/кг.

Приживление трансплантата было зафиксировано на 15-й день после пересадки. У пациента не было обнаружено наиболее частых посттрансплантационных осложнений.

2. Негематологические заболевания

Спектр исследования потенциального применения клеток ПК при негематологических заболеваниях очень широк [инфаркт миокарда, инсульт, «ишемия» нижних конечностей, болезни Паркинсона и Альцгеймера и др.]. Идея такого нетрадиционного применения клеток ПК возникла в связи с появлением сообщений о мультипотентности некоторых из них [в частности ММСК из ПК] [27-29]. Было показано, что клетки ПК [как ММСК, так ГСК] возможно индуцировать к дифференцировке в нейрональном, остеогенном, хондрогенном и гепатоцитарном направлениях. Однако практически все подобные исследования являются до сих пор доклиническими и проводятся в основном на животных.

2.1. Заболевания сердечно-сосудистой системы

Несмотря на то, что в лечении сердечно-сосудистых заболеваний произошел заметный прогресс за последние 5 лет, эта группа болезней является причиной самого высокого показателя смертности среди трудоспособного населения в развитых странах. Различные группы клеток, выделяемых из ПК, проходят доклинические и клинические испытания в кардиологии.

Инфаркт миокарда

При исследовании действия клеток ПК на крупных животных оказалось, что их эффективность сомнительна [30]. Через 5 недель после внутрикоронарного введения моноядерных клеток ПК не было замечено никакого значимого улучшения общей и локальной функции левого желудочка [ЛЖ]. Более того, исследователи сообщают об обнаружении микроинфарктов при гистологическом исследовании миокарда после введения клеток. Однако на грызунах получены противоположные данные. K.Н. Wu с соавт. [2007] сообщают об улучшении сердечной функции в экспериментальной группе крыс после инфаркта миокарда [ИМ], прежде всего за счет увеличения плотности сосудистой сети [31]. Исследователи отмечают также определенную степень дифференцировки пересаженных клеток по экспрессии гладкомышечного актина и тропонина I. Той же точки зрения придерживаются члены японской группы ученых. Согласно их данным, мезенхимальные клетки ПК в процессе со-культивирования с кардиомиоцитами грызунов начинают экспрессировать кардиомиогенные сократительные белки и синхронно сокращаться [32]. Некоторые авторы говорят о спонтанной дифференцировке клеток ПК в кардиомиоциты in vitro. Так, после выделения и кратковременного культивирования клетки начинали экспрессировать Сх-43, SERCA-2, и SDF-1α [33].

Израильские ученые для стимуляции постинфарктного ангиогенеза у безтимусных крыс использовали CD133⁺ клетки ПК человека [34]. Клетки были пересажены через 7 дней после лигирования левой коронарной артерии. По результатам исследования, клетки были способны мигрировать и заселять инфарцированный миокард, а стенка сердца значительно утолщалась по сравнению с контрольными животными. При этом клетки обнаруживали преимущественно около сосудов [в периваскуляроной области] и в самой стенке сосудов.

Исследования на людях гораздо менее многочисленные и лишь косвенно затрагивают деятельность сердечно-сосудистой системы. Так, было опубликовано сообщение о развитии артериального спазма у взрослого пациента при внутривенном введении клеток ПК с целью лечения атипичной хронической миелоидной лейкемии [35]. Через 15 мин. после начала внутривенного введения размороженного и отмытого от ДМСО [криопротектора] образца ПК, совпадающего по антигенам HLA 4/6, у 60-летнего реципиента начался спазм коронарной артерии.

Группа исследователей под руководством W.J. Giessen [Нидерланды] [2007], для изучения эффективности трансплантации клеток ПК [так называемых USSC - unrestricted somatic stem cells - неограниченно делящиеся соматические стволовые клетки], моделировала инфаркт с реперфузией на крупных животных [свиньях] и использовала интракоронарный способ введения клеток [36]. Авторы делают вывод о том, что интракоронарное введение USSC после инфаркта миокарда [ИМ] с реперфузией неспособно предупредить развитие рубцовой ткани в стенке левого желудочка и приводит к ухудшению его функциональной способности. Более того, трансплантация USSC приводит к увеличению размера инфарктной зоны, ее усиленной кальцификации и накоплению лейкоцитов [CD45⁺ и СDЗ⁺-клеток]. В зоне инфаркта не было обнаружено USSC, позитивных по эндотелиальным [фактор фон Виллебранда] и кардиомиоцитарным [сердечный тропонин Т] маркерам. Исследователи подробно анализируют полученные результаты и возможные причины расхождения с положительными данными других авторов, они доказывают, что выбранное ими для трансплантации время после ИМ, продолжительность проспективного наблюдения и выживаемость клеток в зоне инфаркта не могли повлиять на получение негативных результатов. Основную причину неудовлетворительного результата исследования они видят в интракоронарном способе введения USSC, который, по их данным, приводит к повышенному риску микроэмболий мелких сосудов сердца и развитию множественных микроинфарктов, дополнительно ухудшающих функцию левого желудочка. Этот эффект сильнее выражен для культивированных USSC, на поверхности которых повышается экспрессия молекул адгезии, что также способствует прикреплению клеток к эндотелию и закупорке сосудов сердца. Таким образом, судя по результатам этой работы, интракоронарный путь введения USSC, особенно предкультивированных, при ИМ представляется непригодным для использования в клинике. В то же время, учитывая положительные результаты лечения экспериментального ИМ при введении USSC непосредственно в поврежденный миокард, полученные в предыдущем исследовании [37], необходимо определение наиболее оптимального способа трансплантации клеток, одним из которых может стать трансэндомиокардиальный путь введения с помощью специального катетера.

Ишемия нижних конечностей

При сравнении влияния клеток ПК и КМ на развитие сосудистой сети при ишемии нижних конечностей [у NOD/SCID мышей] оказалось, что оба типа клеток оказывают равный терапевтический эффект [увеличивая плотность капилляров на единицу площади мышцы], однако имеют различный фенотип и характеристики роста [38]. При этом в обеих популяциях клеток была ярко выражена экспрессия маркеров моноцитов и эндотелиоцитов [в обеих популяциях - в равной степени], а отличие в паттерне экспрессии приходилось на стромальные маркеры [CD105 и CD73], Экспрессия CXCR4 была значительно выше на клетках ПК, чем на клетках КМ.

В работе японских ученых обсуждается наиболее подходящая популяция клеток - эндотелиальных предшественников для борьбы с ишемией [39]. В данном случае такие клетки имеют низкую активность фермента альдегиддегидрогеназы [aldehyde dehydrogenase]. Доклинические исследования в этой области позволили начать ограниченные клинические испытания, для выяснения безопасности и эффективности метода введения клеток ПК в лечении ишемии нижних конечностей у людей [40].

Таким образом, применение клеток ПК с целью обеспечения терапевтического ангиогенеза становится все более привлекательным, т.к. исследователи приблизились в пониманию фенотипа используемых клеток. Однако, существует нерешенная проблема разработки безопасного способа введения клеток при преодолении последствий ИМ.

2.2. Неврологические заболевания

В данный момент ведутся доклинические исследования применения клеток ПК при нейродегенеративных заболеваниях. Предпосылкой послужили работы, свидетельствующие о способности различных групп клеток ПК дифференцироваться в нейрональные клетки [также разных типов], кроме того, было показано, что эти клетки способны секретировать нейротрофические факторы роста [41, 42].

Поскольку данных in vivo было недостаточно, в новом исследовании V.R. Dasari и соавт. [2007] клетки ПК были пересажены крысам с травмой спинного мозга [на фоне иммуносупрессии] [43]. Восстановление двигательной функции задних конечностей связывали с восстановлением миелинизации демиелинизированных аксонов. По предварительным результатам этой исследовательской группы, клетки ПК [коммитированные в олигодендроциты] синтезировали и секретировали нейротрофические гормоны.

Основные результаты данной работы заключаются в нижеследующем.

1. In vitro осуществлена дифференцировка мононуклеарных клеток ПК под воздействием hEGF/RA в нейроны и олигодендроциты.
2. Доказано выживание и дифференцировка пересаженных клеток в спинном мозге крыс после травмы.
3. Показано, что выжившие клетки секретируют нейротрофические гормоны [через 14 недель после пересадки] - NT3 и
4. Продемонстрировано восстановление локомоторной функции у подопытных животных через 2 недели после трансплантации клеток.

Предложено использовать данную методику в клинических испытаниях.

Другое мнение высказывают авторы статьи в Brain Research Bulletin [44]. По их данным, клетки ПК, культивированные в течение долгого времени, разделялись на несколько популяций, одна из которых несла ранние нейрональные маркеры [nestin и TuJ1], Эти клетки пересадили в неповрежденное нормальное полосатое тело [ядро] мышей NOD/SCID. Через 5 дней проанализировали количество выживших клеток. Клетки присутствовали в месте инъекции и также экспрессировали нейрональные маркеры, однако уже через месяц после трансплантации после повторного анализа пересаженные клетки обнаружить не удалось. Отсутствие Т-клеток, а также минимальные изменения микроглии отвергают версию о Т-клеточном иммунном ответе. Исследователи предполагают, что это обусловлено естественной гибелью клеток, которые были способны долго пролиферировать в культуре, однако не выживали и месяца в мозге реципиента.

Другая группа ученых в качестве прямых претендентов на использование при травме спинного мозга называет CD34⁺клетки [45]. Клетки в носителе [Matrigel] были пересажены в место поражения. Клетки способствовали функциональному восстановлению, ремиелинизации аксонов, однако, клетки обнаруживались и были жизнеспособны на 3-й неделе после пересадки, а на 5-й неделе исчезали полностью [без видимых признаков иммунного отторжения]. Клетки все это время продолжали экспрессировать маркеры ГСК, а не нейрональные маркеры.

Последняя работа была проведена на собаках [46]. Аллогенные ММСК пуповинной крови были использованы для преодоления компрессионной травмы позвоночника. Значительное улучшение отмечено на сроках в 4 и 8 недель, у животных улучшилась скорость проведения нервного импульса.

2.3. Диабет I типа

За последние 3 года исследования по применению ПК в области лечения диабета прошли путь от доклинических экспериментов на животных до нескольких клинических испытаний. Целью одного из них является инфузия аутологичных клеток ПК детям с диабетом 1-го типа для «переустановки» иммунной системы и, возможно, для дифференцировки клеток ПК в инсулин-продуцирующие клетки [47].

Первое сообщение об исследовании клеток ПК на предмет экспрессии маркеров и транскрипционных факторов ß-клеток появилось в 2004 году [48]. Оказалось, что недифференцированные клетки ПК экспрессируют нестин, цитокератин 19 и факторы транскрипции нейрогенин [neurogenin-3, Ngn-3], Рах-4 и lsl—1, которые необходимы для дифференцировки ß-клеток. В недавней работе корейских ученых описана группа ЭСК-подобных клеток из ПК, способная дифференцироваться в инсулин- продуцирующие клетки [49]. Исследователям удалось выделить группу клеток, подобных ЭСК, экспрессирующих SSEA-4 и 0ct4, а затем коммитировать их в инсулин-продуцирующие клетки, одновременно экспрессирующие С-пептид.

В работе японских ученых 2005 года была показана способность клеток ПК дифференцироваться в клетки, продуцирующие инсулин [50]. После внутривенной трансплантации клеток NOD/SCID мышам, человеческие клетки обнаруживали в островках поджелудочной железы. Несмотря на то, что одновременно достаточно сложно оценить происхождение человеческих клеток в поджелудочной железе мышей и их способность секретировать инсулин [т.е. сложно доказать, что именно человеческие клетки секретируют инсулин], было показано, что такие клетки несут как человеческие, так и мышиные хромосомы. Возможно, в этом случае следует говорить о полном слиянии клеток, включая слияние ядер. Однако процент таких клеток по-прежнему крайне невелик [до 1% инсулин-продуцирующих клеток].

Одним из главных осложнений диабета является диабетическая нейропатия - осложнение, связанное прежде всего с нарушением трофики периферических нервов. Как источник эндотелиальных предшественников, а также клеток, продуцирующих факторы роста, эти клетки могут рассматриваться в качестве правомерных кандидатов для терапии данного осложнения [51, 52]. При внутримышечной трансплантации клетки улучшали кровоток в нижних конечностях у животных с диабетом 1-го типа.

2.4. Репопуляция печени и дифференцировка клеток ПК в гепатоциты

Спектр работ, затрагивающих ПК и регенерацию печени, можно разделить на две большие группы. В первой исследователи пытаются получить функциональные гепатоциты из различных клеток ПК [как in vitro, так и in vivo], а представители второй группы работ отслеживают степень химеризации реципиентной печени вводимыми клетками [т.е. репопуляцию печени клетками ПК]. В недавней работе японских ученых клетки ПК были пересажены двум группам мышей NOD/SCID: с временным и хроническим поражением печени [53]. После трансплантации оценивали присутствие гепатоцитоподобных клеток человеческого происхождения в мышиной печени. Через 3 недели было обнаружено лишь небольшое количество гепатоцитоподобных клеток. Во второй группе [ген урокиназы находился под альбуминовым промотором ALB-uPA/SCID mice], напротив, было обнаружено большое количество клеток человеческого происхождения.

И в том, и в другом случае клетки экспрессировали некоторые маркеры гепатоцитов, например, цитохром P450s, альбумин, α-фетопротеин. Эти данные свидетельствуют о том, что клетки ПК способны приобретать фенотип гепатоцитов [пусть и в разной степени], а при хроническом нарушении способны дифференцироваться в зрелые гепатоциты, компенсируя их недостаток. Другие исследователи сообщают о пересадке CD34⁺ клеток мышам линии NOD/SCID/ [NOG] - эта линия характеризуется очень высокой степенью химеризма при трансплантации ГСК человека [54]. В печени таких мышей после трансплантации был зафиксирован высокий уровень клеток, экспрессирующих человеческий альбумин и α-1-антитрипсин. Альбумин также выделяли из мышиной сыворотки, что говорит о функциональной зрелости человеческих гепатоцитов. Цитофлуориметрический анализ суспензии клеток печени подопытных мышей показал также экспрессию на одних и тех же альбумин-положительных клетках - МНС человека и мыши и отсутствие CD45. ПЦР анализ подтвердил данные о том, что клетки экспрессируют целый спектр человеческих белков - маркеров гепатоцитов и холангиоцитов. Эти результаты предполагают слияние пересаженных CD34⁺ клеток с гепатоцитами NOG-мышей без нарушения работы их печени. При этом клетки теряли свой гематопоэтический фенотип и становились клетками, экспрессирующими гены, специфичные для клеток печени. Подобного явления не наблюдали при пересадке CD34 клеток.

В работе немецких ученых мононуклеарные клетки пересаживали мышам с токсическим поражением печени [индукция четыреххлористым углеродом] и наблюдали формирование гепатоцитоподобных колоний. Эти клетки экпсерссировали человеческий альбумин и Hep Par 1, однако мышиный цитокератин 18 [СК18]. Авторы предположили формирование химерных гепатоцитов, однако не предлагали никакого механизма, объясняющего это явление [55].

Еще одним способом дифференцировки клеток ПК в гепатоциты является их сокультивирование с клетками CFSC/HGF⁺ фидерными клетками. В результате такого метода клетки ПК приобрели фенотип CD34[+/-]CD90[+/-] CD49f[+]CD29[+]Alb[+]AFP[+] [56]. А через 7 дней после сокультивирования клетки ПК приобрели морфологию гепатоцитов. ПЦР продемонстрировала экспрессию генов AFP, Alb, CYP1B1 и цитокератинов СК18 и СК19.

3. Проблемы и осложнения

3.1. Реакция «трансплантат-против-хозяина» [РТПХ]

Реакция «трансплантат-против-хозяина» является наиболее частым осложнением после аллогенной пересадки клеток ПК. Именно этот эффект противостоит нормальному

восстановлению кроветворения и требует дополнительных иммуносупрессивных мероприятий. РТПХ и ее лечение значительно повышают риск присоединения последующих инфекций, а значит и количество летальных исходов. Известно, что РТПХ значительно снижается при применении в неродственной трансплантации клеток ПК. Это связывают с незрелостью Т-клеток, а также с присутствием в трансплантате Т-регуляторных клеток, подавляющих аллогенный иммунный ответ. Пуповинная кровь содержит большие количества Т-клеток, экспрессирующих CD45RA⁺/ CD45R0 , CD62L⁺ [57]. Кроме того, некоторые исследования свидетельствуют в пользу синтеза клетками ПК противовоспалительных хемокинов, например, 11-10, которые могут подавлять РТПХ [58].

У детей после неродственной трансплантации вероятность развития РТПХ составляет 20-50%, хронической РТПХ 5-30%. Важно также отметить, что трансплантаты ПК, как правило, совпадают по молекулам первого класса генов гистосовместимости на антигенном уровне, а для второго класса - на уровне аллелей. Очевидно, что при трансплантации двух образцов ПК вероятность развития РТПХ должна удваиваться.

3.2. Аллогенная трансплантация двух образцов ПК

В связи с растущим интересом к ПК уже несколько лет предпринимаются попытки использовать ее при трансплантации взрослым реципиентам. Следовательно, потребовались большие количества клеток, т.к. их число традиционно рассчитывается с учетом веса пациента. Поэтому обычных объемов ПК [40-100мл] стало недостаточно для достижения выраженного терапевтического эффекта. Таким образом, появилась практика использования двух образцов, точнее их одновременной или последовательной пересадки взрослому пациенту [59].

В работе французских гематологов описано 4 клинических случая применения двух образцов ПК после неудачной первичной трансплантации [раннее отторжение трансплантата] при различных заболеваниях [60]. В своих выводах исследователи отмечают, что пересадка двух даже неродственных образцов является большим преимуществом при лечении многих типов заболеваний, прежде всего из-за своей доступности. Особенно в случаях отторжения первого трансплантата. Кроме того, авторы работы также предлагают использовать пониженный режим кондиционирования при вторичной двойной пересадке. Немаловажное значение имеют сроки выполнения процедуры. Было показано, что на поиск неродственного донора ГСК уходит в среднем 29 дней, тогда как в случае ПК время между принятием решения и пересадкой второго образца может максимально занимать 15 дней [61]. Поэтому в таких случаях замороженные образцы ГСК из ПК являются идеальным источником.

До сих пор неясно, как влияет на приживление пересадка двух образцов ПК, по сравнению с одним. В исследовании J.N. Barker и соавт. [2005] у 21 пациента из 23, которым была проведена трансплантация двух образцов, на 23-й день был обнаружен энграфтмент по крайней мере одного из пересаженных образцов, и этот показатель значительно превышает уровень приживления после трансплантации одного образца ПК [62]. Скорее всего, в результате сложных иммунологических процессов [невыясненных на данный момент] происходит приживление лишь одного образца в большем количестве случаев.

Стоит упомянуть, что группой J.N. Barker проведено более 200 пересадок двух образцов [после миелоабляции и немиелоаблативного режима], по результатам которых 90% взрослых пациентов были отнесены к группе «пригодных к трансплантации клеток ПК».

Кроме того, опубликовано исследование, проведенное на 96 взрослых, больных острым лейкозом [63]. Им была проведена трансплантация как одного, так и двух образцов ПК. Реципиенты двух образцов были тяжелее по массе [ в среднем 70 кг по сравнению с первой группой - 32 кг] и старше по возрасту [24 года против 8 лет в первой группе]. Кроме того, исследователи заметили, что при наиболее распространенной трансплантации образцов, совпадающих с реципиентом по 4 из 6 антигенов HLA [что как правило связывают в повышенным риском развития РТПХ], чаще развивается реакция «трансплантат против лейкоза». Многочисленные центры в Европе, Японии и Америке начали проводить вторую фазу клинических исследований использования клеток ПК у взрослых пациентов, а американская сеть Clinical Trials Network [CTN], финансируемая NIH, запустила рандомизированные исследования 3-й фазы у детей по сравнительной оценке использования одного и двух образцов ПК. Таким образом, уже сейчас можно говорить о преимуществах пересадки двух частично совпадающих образцов, что привело к рассмотрению возможности трансплантации и большего количества образцов для повышения «клеточности» трансплантата [64].

Отдельно стоит сказать об облегченном режиме кондиционирования. Эго прежде всего относится к взрослым пациентам. Несмотря на то, что оптимальный режим химиотерапии, предваряющей использование клеток ПК, еще предстоит подобрать, уже сейчас понятно, что такой агент как «флюдарабин» играет ключевую роль в данном вопросе [65-68]. Сообщается о восстановлении количества нейтрофилов до нормального уровня между 9 и 20 днем [после пересадки ПК], с одинаковыми показателями приживления как при трансплантации одного образца, так и двух. В исследовании С. Brunstein и соавт. [2005] описано 150трансплантаций после немиелоаблативного режима лечения. Средний возраст пациентов в этой группе составил 50 лет. Режим кондиционирования [Minneapolis Regimen] был следующим: флюдорабин 40 мг/м²/сут. - 5 дней, циклофосфамид 50 мг/кг/сут. - 1 день в сочетании с низкими дозами облучения. 80% таких пациентов получили двойную дозу клеток ПК и, несмотря на значительно значительный возраст и сопутствующие заболевания, смертность через 6 мес. после трансплантации составила 18%. Развитие острой РТПХ ІІІ—ІѴ степени составило 25%, а хронической РТПХ - также 25%. В этой группе пациентов, крайне гетерогенной по диагнозу и фазам развития заболеваний, средняя выживаемость составила 44% в течение двух лет. Количество рецидивов было значительно снижено, а количество пациентов, выживших без возобновления болезни было выше в группе с двойными трансплантациями. При этом возраст пациентов, как отмечают авторы работы, не являлся фактором риска, поэтому они призывают не рассматривать этот критерий при включении пациентов в группу исследований действия клеток ПК. Единственным недостатком щадящего режима кондиционирования, как оказалось, является повышенная возможность заражения вирусом Эпштейна-Барра [64].

Вышеперечисленные результаты позволяют предлагать использование щадящего режима и последующей пересадки двух образцов ПК для преодоления фактора недостаточного количества клеток. Относительный вклад этих двух составляющих терапии, а также последовательность и механизмы процессов, протекающих в организме после пересадки, остаются невыясненными.

3.3. Незатронутые вопросы и перспективы исследований

Неродственная трансплантация клеток ПК все прочнее занимает свою позицию в ряду стандартных медицинских процедур [прежде всего у детей, и все больше и больше - у взрослых]. Однако, ряд вопросов остается невыясненным до конца.

1. Как обеспечить необходимое количество образцов ПК в связи с растущей потребностью в двух образцах при пересадке взрослому пациенту?
2. Как помочь банкам ПК [как государственным, так и частным] соответствовать все растущим требованиям к процессингу, хранению и типированию, предложенными сетью FACT-NETCDRD, American Association of Blood Banks [American Association of Blood Banks, 2001; FACT- NETCORD, 2001] и другими органами, регулирующими работу банков ПК?
3. Как снизить стоимость выделения и хранения образцов?
4. Имеет ли преимущество использование клеток ПК совместно с периферической кровью гаплоидентичного донора, а также с одновременным введением регуляторных Т-клеток [для предупреждения развития аутоиммунных процессов и улучшенного химеризма]?

Например, 11 пациентам был пересажен один образец ПК, совместно с CD34⁺ клетками периферической крови от одного из членов семьи [70, 71]. Приживление нейтрофилов наступало, в среднем, на11 день. У 4 пациентов развилась острая РТПХ, а 5 пациентов оказались здоровы через 43 месяца после трансплантации.

Заключение

К сожалению, основной трудностью при анализе научной литературы, касающейся применения клеток ПК при лечении различных заболеваний, является ее гетерогенность - описанные исследования проводят при несравнимых режимах лечения, применяемые дозы клеток и скорости введения также разнятся. Кроме того, стадии заболевания и время введения клеток также не всегда одинаковы. Все это не позволяет сделать однозначные выводы об эффективности использования клеток ПК по сравнению с традиционными тансплантациями при каждом конкретном случае. Однако уже сейчас понятно, что различные группы клеток из ПК являются незаменимыми при лечении 10-15 заболеваний у детей, и являются перспективными для применения у взрослых. Клетки ПК стали «равноправным» источником ГСК для аллогенной трансплантации, их стали гораздо чаще использовать как замену КМ при отсутствии подходящего по HLA донора. Количество клеток в образце также становится менее критичным параметром с введением щадящей химиотерапии и значительно расширяет спектр предполагаемых реципиентов ПК, включая пациентов всех возрастов. В табл. 4 представлены некоторые основные направления наиболее перспективных исследований в области применения ПК в клинической практике [цит. по Brunstein C.G., Setuba D.C., Wagner J.E. Expanding the role of umbilical cord blood transplantation. Br. J. Haematol. 2007; 137: 20-35].

Таблица 4. Новые тенденции использования клеток ПК

Стратегия	Цель	Этап развития	Комментарий
Трансплантация двух образцов ПК	Улучшение уровня приживления клеток, возможность включения в терапию взрослых пациентов	II фаза клинических испытаний	III фаза клинических испытаний в разработке
Пересадка клеток ПК после немиелоаблативной терапии	Возможность включения в терапию взрослых пациентов на более поздних стадиях заболевания	II фаза клинических испытаний	Разработка многоцентровых испытаний II фазы
Ex vivo экспансия прогениторных клеток ПК	Улучшение приживления трансплантата	І-ІІ фазы клинических испытаний	Нет очевидных преимуществ в процессе клинических исследований, нет токсичности клеток
Отдельная совместная (с ГСК ПК) трансфузия Т-регуляторных клеток ПК	Улучшение приживления трансплантата при отсутствии РТПХ	Поздние доклинические исследования
Отдельная совместная (с ГСК ПК) трансфузия НК клеток ПК	Лечение острого миелоидного лейкоза	І-ІІ фазы клинических испытаний
Инфузия ГСК ПК в костный мозг	Улучшенный хоуминг и приживление клеток	І-ІІ фазы клинических испытаний	При трансплантации двух образцов один вводят внутривенно, второй - в подвздошную кость
Совместная инфузия с ММСК КМ	Улучшение приживления	I фаза клинических испытаний	Треть - ММСК
Совместная инфузия с частично совпадающими CD34+ клетками	Укороченный период нейтропении	II фаза клинических испытаний	Треть - CD34+ клетки
Использование мультипотентных клеток ПК (ММСК или USSC)	Регенерация различных типов тканей	I фаза клинических испытаний	На стадии развития