Sozdanie transgennykh indutsirovannykh plyuripotentnykh stvolovykh kletok, prednaznachennykh dlya izucheniya molekulyarnogeneticheskikh mekhanizmov patogeneza bolezni Parkinsona i testirovaniya perspektivnykh lekarstvennykh soedineniy

全文:

Болезнь Паркинсона (БП) является одним из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний. Молекулярно-генетические механизмы БП на данный момент изучены недостаточно. Одним из перспективных способов решения данной проблемы является создание клеточных моделей, которые позволят изучать конкретные механизмы патогенеза данной болезни in vitro, и, следовательно, позволят глубже понять причины и выяснить роль различных молекул в развитии патологических процессов. Одними из патологических проявлений болезни Паркинсона на клеточном уровне являются повышенная продукция и чувствительность к активным формам кислорода, а также формирование цитотоксичных (олигомерных) форм белка a-синуклеин. В рамках данной работы были получены и охарактеризованы линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациента (женщина 55 лет, с ранним дебютом БП - в 38 лет), имеющего полиморфизм c.C1256T в гене LRRK2. На основе данных линий, с применением CRISPR/Cаs9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1, были созданы трансгенные клоны, несущие доксициклин-управляемый трансген биосенсора окислительно-восстановительного потенциала глутатиона - Cyto-Grx1-roGFP2. Используя эту же схему были получены клоны ИПСК содержащие док-сициклин-управляемый трансген a-синуклеина (SNCA), имеющий на С-конце эпитопы 3xFLAG и 2xStrep-Tag II, предназначенные для тандемной аффинной очистки белковых комплексов. Показано, что ИПСК, несущие докси-циклин-управляемый трансген Cyto-Grx1 -roGFP2 могут быть направленно дифференцированы в производные, которые экспрессируют маркёры характерные для дофа-минергических нейронов (TH, LMX1A, F0XA2, NURR1) и общий нейрональный фактор (p-III-тубулин). Кроме того, была подтверждена активность биосенсора Cyto-Grx1-roGFP2 в условиях окисления/восстановления внутриклеточной среды на клетках, прошедших диффе-ренцировку в сторону дофаминергических нейронов. С помощью количественной ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот анализа подтверждена управляемая экспрессия трансгена SNCA с эпитопами 3xFLAG и 2xStrep-Tag II на С-конце белка. Показано, что наличие эпитопов не мешает формированию димерных форм a-синуклеина. Таким образом, была создана клеточная платформа для качественного и количественного исследования окислительно-восстановительного потенциала глутатиона и изучения интерактома a-синуклеина в релевантных типах клеток пациента, страдающего болезнью Паркинсона.

作者简介

Sergey Medvedev

Email: medvedev@bionet.nsc.ru

El'vira Bayramova

Dinara Sharipova

Viktoriya Kovalenko

Elena Grigor'eva

Suren Zakiyan

参考

补充文件