Combined use of plasmid drug pCMV-VEGFA and autodermoplasty for stimulation of skin defects healing in the experiment

全文:

Бведение Поиск новых способов лечения длительно незаживающих кожных ран, представленных в основном глубокими ожогами, диабетическими и трофическими язвами, является актуальной междисциплинарной задачей [1, 2]. По данным статистического вестника Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2016 г., в России 4,4 млн человек страдают сахарным диабетом [3], у 5 % из них (220 тыс. человек) развиваются диабетические язвы. В общемировом масштабе по статистике ВОЗ на 2015 г. у 21,1 млн больных сахарным диабетом имеются язвенные поражения кожи [4]. Численность пациентов с трофическими язвами в России в 2016 г. составила 186 тыс. человек [3], в мире около 21 млн [5]. В 2016 г. в России с ожогами было госпитализировано 150 тыс. человек [3], из которых 45 тыс. имели поражение III-IV степени [6]. Несмотря на наличие традиционных способов лечения пациентов с данной патологией, в 2016 г. из 21,1 млн больных с синдромом диабетической стопы у 1 ,5 млн пришлось выполнить ампутацию нижней конечности на различных уровнях [4]. При этом почти 70 % Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 91 больных сахарным диабетом умирают в первые два года после ампутаций, из оставшихся - 53 % передвигаются при помощи вспомогательных средств [7]. летальность при обширных ожогах (более 20 % площади поверхности тела) составляет 30 % [6]. существуют протоколы стандартных методов лечения хронических кожных ран. Протокол лечения пациента с синдромом диабетической стопы предполагает два этапа: в ходе консервативного этапа проводится компенсация сахарного диабета, разгрузка конечности, а также местное лечение с целью профилактики и лечения инфицирования раны. второй этап - это хирургическое лечение, золотым стандартом которого является аутодермопластика [8]. Однако данный способ нередко сопровождается в последующем лизисом трансплантатов, частота которого достигает 20-40% [9]. Основной причиной возникновения длительно незаживающих кожных ран и низкой эффективности большинства стандартных методов лечения является недостаточная регенеративная способность кожи, вызванная как проявлениями звеньев патогенеза основного заболевания (в случае сахарного диабета - ангио- и нейропатии, больших объемов повреждения при ожогах), так и со снижением количества и функциональной активности факторов регуляции репарации, а также влиянием сопутствующих заболеваний - атеросклероза и хронической венозной недостаточностью нижних конечностей [10]. Неэффективность аутодермопластики связана так же с ишемизацией патологической зоны, что мешает эффективному приживлению кожного лоскута [11]. Таким образом, одним из способов патогенетического лечения хронических кожных ран может быть реализация принципов терапевтического ангиогенеза (группы методов, целью которых является компенсация перфузии ишемизированных тканей посредством индукции естественных процессов образования и роста сосудов) [12]. Одним из главных ростовых факторов, участвующих в процессах ангиогенеза, является VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, сосудистый эндотелиальный фактор роста) [13]. В ранних работах по физиологической регенерации кожи показана значительная роль данного фактора, его экспрессия индуцируется в кератиноцитах гипоксией, это приводит к стимуляции васкуляризации дермы, а, следовательно, и к улучшению диффузного кровоснабжения эпидермиса [14], что в свою очередь ускоряет процессы пролиферации, дифференцировки, корнифи-кации [15]. Способностью экспрессировать и секрети-ровать VEGF обладают и другие виды клеток, которые участвуют в заживлении ран: фибробласты [16], гладкомышечные клетки [17], тромбоциты [18], нейтрофи-лы [19] и макрофаги [19]. Необходимо отметить, что VEGF обладает также антиапоптотическим влиянием на многие виды клеток, в том числе эндотелиальные [20, 21]. Цель исследования - оценить потенциал применения аутодермопластики в сочетании с плазмидным препаратом pCMV-VEGFA для оптимизации заживления полнослойных кожных дефектов в эксперименте. Материал и методы Экспериментальные процедуры были одобрены Локальным этическим комитета Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Предварительно был проведен пилотный эксперимент для оценки эффективности трансфекции и длительности экспрессии гена при внутрикожном введении плазмиды. В эксперимент были включены 3 группы животных (самцы мыши линии Balb/c), первой группе (n=3) производилась однократная внутрикожная инъекция раствора 100 мкг плазмиды, несущей ген люцифера-зы светлячков (Pl-Luc) (любезно предоставлена П.И. Макаревичем, МГУ, Москва) в 100 мкл воды для инъекции, второй группе (n=2) раствор воды для инъекции в количестве 100 мкл, третьей группе (n=2) выполнялась аналогичная инъекция раствора 100 мкг pCMV-VEGFA (лекарственный препарат «Неоваскулген» регистрационное удостоверение №ЛП-000671 от 28.09.2011) в 100 мкл воды для инъекции. Экспрессия оценивались на 1, 7, 10 сут. после инъекции при помощи прибора для детекции люминесценции IVIS Spectrum (Perkin Elmer, Santa Clara, США) через 5 мин. после внутрибрюшинного введения раствора най-триевой соли D-люциферина (ООО «Люмтек», Москва) из расчета 150 мкг/кг массы тела животного (время экспозиции 10 сек.). При введении раствора люциферина в присутствии АТФ и кислорода и при участии люциферазы происходит двухэтапная реакция с образованием оксилюциферина, интенсивность люминесценции которого прямо пропорциональна экспрессии люциферазы клетками и напрямую связана с эффективностью трансфекции клеток кожи, соответствующей плазмидой [22]. Обработка полученных изображений люминесценции была произведена в программе Living image® (Perkin Elmer, США), результаты представлены в виде значений показателя люминесценции (количество фотонов / сек. /см2 / угол (стерадиан); (p / s / cm2 / sr)). Вторым этапом исследования являлось изучение влияния прямой генной терапии плазмидой pCMV-VEGFA при заживлении полнослойного дефекта кожи у крыс после проведения аутодермопластики. Под наркозом на предварительно выбритом и продезинфицированном участке межлопаточной области у крыс (самцы линии Wistar, вес 250-300 гр.) выполнялась отсепаровка полнослойного кожного лоскута размерами 2x2 см, который после двухминутной экспозиции в стерильном физрастворе ротировался на 180 градусов по ости и пересаживался в раневое ложе, фиксировался по периметру узловыми швами (Vicryl 3.0, Ethicon Inc., США). Рана обрабатывалась спреем «Баймицин Аэрозоль» (раствор окси-тетрациклина гидрохлорида 32,2 мг/мл, Norbrook Laboratories Limited). Восьми животным производилась внутрикожная инъекция 1 мл раствора, содержащего 0,3 мг сверхскручен-ной плазмиды pCMV-VEGFA, по периферии дефекта кожи в 8 точек по 0,125 мл на одну точку. Контрольным животным (n=8) производилась инъекция 1 мл физраствора аналогичным образом. Для оценки микроциркуляции под трансплантатом и в области краев дефекта производилась лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) с помощью прибора Easy-LDl (AIMaGo, Швейцария). Производилась количественная оценка показателя микроциркуляции (ПМ) в центре лоскута и в интактной части кожи (0,5 см кнаружи от каудального края раны), где ПМ = К x №р x Vср (К - коэффициент пропорциональности, №р - концентрация эритроцитов в зондируемом объеме ткани, Vср - средняя скорость эритроцитов в микроциркуляторном русле) и вычисление отношения ПМ в центре лоскута к ПМ интактной кожи. Результаты ЛДФ выражались в %, в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 92 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Макроскопическая оценка пересаженного трансплантата и лдФ проводились на 3, 6, 9, 12, 18 сут. для гистологического исследования аутотрансплантат с окружающей его кожей на расстоянии 0,51 см со всеми слоями и частью мышц спины забирали на 12 и 18 сут. и фиксировали в 10 % забуференном формалине. Парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и иммуногистохимически с антителами к аГМА (а-гладкомышечный актин, клон F5D, Dako (Denmark), 1:50), детекцию иммунных комплексов производили с помощью системы Novolink (Novocastra, Великобритания). Цифровые гистотопограммы получали при помощи сканера гистологических препаратов Aperio CS2 (Leica, Германия) и исследовались при помощи программы Image Scope (Leica, Германия). Производились измерение расстояния (мм) между краями раны и подсчет количества кровеносных сосудов в трех зонах (под лоскутом, на периферии лоскута и в кожной мышце) в 10 полях зрения при увеличении х40. Расстояние между краями раны и количество сосудов выражали в виде среднего ± стандартное отклонение. Статистический анализ результатов морфометрии и значений ЛДФ проводился с помощью U-критерия Манна-Уитни в программе STATISTICA 8.0. c уровнем значимости p<0,05. Результаты и обсуждение Эффективность трансфекции и длительность экспрессии трансгена при внутрикожном введении плазмиды В ходе эксперимента были полученные данные об устойчивой экспрессии люциферазы как минимум в течение 7 дней (табл. 1, рис. 1). Рис. 1. Уровень люминесценции на 1 (А), 3 (Б), 7 (В) сут. Таблица 1. Показатели люминесценции (p/s/cm2/sr) Группа 1 сут. 3 сут. 7 сут. Плазмида, несущая ген люциферазы 400500 204600 67230 Контроль 0 0 0 pCMV-VEGFA 0 0 0 Таким образом, е о н ж о и р т у н в ведение плазмиды способно обеспечить стабильную и продолжительную экспрессию терапевтического гена, что позволяет использовать плазмиду в качестве вектора для доставки VEGF для комбинированного применения при лечении кожных ран. Влияние плазмидной конструкции pCMV-VEGFA на заживление дефектов кожи В группе с введением физраствора уже на 3 сут. макроскопически отмечался некроз аутотрансплантата. В группе с плазмидой в одном случае констатировали полное приживление аутотрансплантата, лоскут был схож с интактной частью кожи, за исключением отсутствия волосяного покрова. Эпидермис и дерма имели строение интактной кожи. Толщина эпидермиса кожного лоскута составляла 101±8,4 мкм против 35±8,5 мкм в интактной части кожи (результат избыточности процессов регенерации), сохранялись все клеточные слои. В толще дермы в отличие от остальных образцов имелись волосяные фолликулы, отсутствовала развития грануляционная ткань, отмечено четкое разделение на сосочковый и сетчатый слои, отсутствовали признаки повреждения кожной мышцы (рис. 2). В остальных случаях в группе c плазмидой отмечалась гибель пересаженного кожного лоскута, которая происходила на более позднем сроке (6 сут.), чем в группе контроля (рис. 3). Заживление кожной раны происходило по третьему типу («заживление под струпом») [23], поэтому дальнейшая тактика оценки влияния терапевтического эффекта плазмиды заключалась в измерении размеров расстояния между краями дефекта под пересаженным кожным лоскутом. т о , v; 2 . 1 - аутотрансплантат 2 - интактная часть кожи Рис. 2. Полностью прижившийся кожный лоскут (группа pCMV-VEGFA): А - гистотопограмма; 1 - дерма лоскута; 2 - дерма краевой зоны кожи реципиентного ложа; В - участки гистотопограммы, включающие многослойный плоский эпителий и ремоделирующуюся дерму. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: А х40, х400 Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 ОРИГИНАЛьНыЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 93 После операции 6 сут. 12 сут. 18 сут. f , І Рис. 3. Внешний вид области аутодермопластики в контрольной группе и группе pCMV-VEGFA на этапах эксперимента Таблица 2. Показатели микроциркуляции Группа Сутки После операции 3 6 9 12 18 Контроль 75±8,4 % 35,6±6,5 % 62,2±5,3 % 55,1±3,5 % 58,7±3,7 % 82,2±9,2 % pCMV-VEGFA 70,53±9,5 % 38,0±5,9 % 59,0±5,9 % 56,9±5,9 % 59,9±4,5 % 88,7±3,5 % По данным ЛДФ было выявлено, что процессы ангиогенеза наиболее интенсивно происходят под лоскутом, преимущественно в краевых зонах, однако меж-групповые различия показателя объемного кровотока в центральных участках не были статистически значимы, что может быть объяснено наличием плотного струпа, который препятствует точной и объективной оценке кровотока под ним, как в контрольной, так и в группе с pCMV-VEGFA (табл. 2). Регенерация эпителия осуществлялась ростом пласта эпидермиса с краев дефекта кожи в обеих группах. В обеих группах нарастающий с краев эпидермис был представлен 2-3 слоями кера-тиноцитов. Морфометрически установлено, что размеры раневого дефекта в группе с pCMV-VEGFA на 12 сут. составляли 5,52±4,80 мм, в контроле - 12,45±0,82 мм (p=0,03), а на 18 сут. 2,53 ±2,94 мм, в контроле - 4,23±3,5 мм (p>0,05) (рис. 4), что свидетельствует об опережающей регенерации в экспериментальной группе на ранних сроках, однако к финалу эксперимента это преимущество нивелируется. Рис. 4 VEGFA- Контроль ■ pCMV-VEGFA 12 Сутки . Размеры дефекта кожи в контрольной и pCMV-группах через 12 и 18 сут. В ряде случаев, регенерирующий эпидермис врастал в лоскут и расщеплял его продольно на вышележащий слой некротизированного эпидермиса с частью сосочкового слоя дермы (струп) и нижележащий слой (кожная мышца с частью сетчатого слоя дермы). Данный феномен с одинаковой частотой наблюдался в обеих группах. Процессы регенерации дермы под некротизирован-ным трансплантатом характеризовались к 1 2 сут. формированием грануляционной ткани, а к 1 8 сут. образованием рубца, более грубым в контроле, чем в группе с pCMV-VEGFA. В группе с плазмидой количество сосудов грануляционной ткани в поле зрения к 18 сут. было статистически значимо больше по сравнению с контрольной группой и составляло: под лоскутом 26±2,9, тогда как в контроле 20±8 (p>0,05), по периферии - 27±3,4 и 12,1±3,9 (p=0,035), соответственно. В кожной мышце - 21,2±3,9 и 12,4±3,6 (p=0,04), соответственно (рис. 5). К тому же в группе с плазмидой отмечалось более упорядоченное формирование сосудов. Патогистологический анализ показал, что в области повреждения у животных группы контроля к 12 сут. имеются некроз кожной мышцы кожного лоскута и её нейтрофильная и макрофагальная инфильтрация. К 18 сут. в ней в следствие протекания регенерационного рабдомиогистогенеза происходило формирование мышечных трубочек и «молодых» мышечных волокон. В группе с pCMV-VEGFA кожная мышца сохраняла жизнеспособность, отмечено четкое разграничение границ кожной мышцы и прилежащих тканей. Заключение Таким образом, установлено, что комбинированное применение плазмидного препарата pCMV-VEGFA и аутодермопластики для лечения кожных дефектов в эксперименте имеет ряд положительных отличий Гены & Клетки Том XIII, № 1, 2018 94 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Кожная мышца В центре под трансплантом На переферии 2 CD ш > > О і ‘ä щ ; % Ті * 6* I ' 4*s& {< і ».-я1 *ДЛі:,-Зжч4-’ ' j» <S"V\ ' * ^ > • ;■■•■■"■; г 1 Ï 1 f ■f ж ’1 ? 1 1 4 * ) Ш ■ . ,1 Рис. 5. Область кожной пластики у животных обеих групп через 18 сут. иммуногистохимическая реакция с антителами к а-ГМА. докраска гематоксилином. Ув. х400 в сравнении с контрольной группой, а именно: ускорение процессов реэпителизации раны и ангиогенеза, поддержание жизнеспособности отдельных структур аутотрансплантата (кожной мышцы). дальнейшие исследования помогут подобрать условия для лучшего проявления терапевтического эффекта, что даст предпосылки использования и создания лекарственного препарата или медицинского изделия, предназначенного для оптимизации заживления кожных ран различной этиологии.

作者简介

A. Bilialov

Kazan (Volga region) Federal University

Email: BilyalovAir@yandex.ru

M. Abyzova

Kazan State Medical University

A. Titova

Kazan (Volga region) Federal University

M. Mavlikeev

Kazan (Volga region) Federal University

AA. Krilov

Ryazan State Medical University

I. Bozo

Human Stem Cell Institute; Federal Medical Biophysical Center, FMBA of Russia

R. Deev

Ryazan State Medical University; Human Stem Cell Institute

参考

补充文件