Analiz vliyaniya ektopicheskoy ekspressii disferlina na proliferativnuyu aktivnost' kletok HEK293A posle elektroporatsii

Аннотация

Толық мәтін

Возникновением мутаций в гене дисферлина (DYSF) человека обусловлено развитие дисфер-линопатий, группы нейромышечных заболеваний, включающей миопатию Миоши, конечностно-по-ясную мышечную дистрофию типа 2Б, дистальную миопатию переднего ложа голени и проксимально-дистальные формы. Известно, что дисферлин участвует в образовании системы Т-трубочек, что придает клеточной мембране трубчатую форму. Описано накопление данного белка в местах повреждения сарколеммы мышечных клеток. В связи с этим предполагается участие данного белка в процессах репарации сарколеммы. Синтез нефункционального белка или его недостаточность вследствие мутаций в гене DYSF приводит к нарушению процессов восстановления сарколеммы и везикулярного транспорта, что опосредует дегенеративные и воспалительные процессы в мышечной ткани. Однако остаются неясными основные молекулярные и клеточные механизмы участия дисферлина в процессах репарации клеточных мембран. В настоящей работе проанализировано влияние эктопической экспрессии дисферлина на пролиферативную активность эмбриональных клеток почки человека HEK293A после повреждения клеточной мембраны методом электропорации. Для достижения эктопической экспрессии дисферлина клетки HEK293A трансфицировали ранее полученным плазмидным вектором pCMV-DYSF, кодирующим кДНК гена дисферлина человека. Трансфекцию проводили с использованием реагента TurboFect (ThermoFisherScientific, США) по методике, рекомендуемой производителем. Для оценки эффективности трансфекции и сравнительного анализа клетки HEK293A трансфицировали плазмидным вектором pEGFP-N2 (Clontech, США), экспрессирующим улучшенный зеленый флуоресцентный белок EGFP. Электропорацию клеток проводили через 48 ч. после трансфекции на приборе GenePulserXcell™ ElectroporationSystems ( Bio-R ad, США) при напряжени и 200 В и времени импульса 25 мс в 0,4 см кювете. Активность митохондриальных дегидрогеназ, характеризующую пролиферативную активность клеток, оценивали с использованием набора CellTiter96 AQueousNon-RadiactiveCellProliferationAssay (Promega, США) через 48 ч. после электропорации. Показано, что после электропорации пролиферативная активность клеток HEK293A, трансфицированных плазмидой pCMV-DYSF (HEK293A-DYSF), снизилась на 20% по сравнению с клетками HEK293A-DYSF без электропорации. Интересно, что электропорация снижала пролиферативную активность клеток HEK293A, трансфицированных плазмидой pEGFP-N2 (HEK293A-EGFP), на 40% в сравнении с клетками HEK293A-EGFP без электропорации. Таким образом, после электропорации пролиферативная активность клеток HEK293A-DYSF была на 20% выше клеток HEK293A-EGFP. Данные результаты могут указывать о положительном влиянии экспрессии дисферлина дикого типа на процессы репарации мембран в клетках человека. Однако для подтверждения данной теории необходимы дальнейшие исследования с использованием других типов клеток и повреждающих мембраны воздействий.