Receptor tyrosine kinases c-Met and ErbB-2 can be activated by extracellular alkaline medium

Abstract

Full Text

Рецепторные тирозинкиназы - семейство трансмембранных белков, которые узнают различные факторы роста, цитокины и гормоны. Было показано, что рецепторные тирозинкиназы не только являются ключевыми регуляторами нормальных клеточных процессов, но также играют критическую роль в развитии и прогрессировании многих типов рака. Исследуемые тирозинкиназы c-Met и ErbB-2 также являются протоонкогенами. Нами было недавно показано, что IRR, структурный гомолог рецептора инсулина, является pH-чувствительной тирозинкиназой, регулирующей кислотно-щелочной баланс. Данное открытие побудило к поиску других рецепторных тирозинкиназ, которые активируются при изменении рН. Программа AlcalPred может применяться для прогнозирования чувствительности к рН других белков. Проведя с помощью этой программы полный анализ всех эктодоменов рецепторных тирозинкиназ человека, мы обнаружили, что только 9 рецепторов могут потенциально быть «щелочно-зависимыми» белками. ErbB-2 заинтересовал нас, так как это рецептор-сирота из семейства рецепторов EGFR. Чтобы проверить, может ли ErbB-2 стимулироваться щелочной средой, мы трансфецировали клетки линии HEK293T плазмидой, несущей человеческую кДНК ErbB-2 с HA-меткой на С-конце рецептора, и инкубировали их в PBS, доведенным 60 мМ Трис-HCl до pH 7,4 или 9,0. В результате мы обнаружили, что ErbB-2 аутофосфорилируется в слабощелочной среде, причем эта активация дозозависима и не зависит от состава буфера. Для c-Met существует лиганд-зависимый способ активации с помощью фактора роста гепатоцитов, однако необходимо было проверить гипотезу pH-чувствительности рецептора. Ранее мы показали, что клетки CAKI-1 реагируют на щелочную обработку изменениями фосфорилирования белков. Посредством преципитации с антителами против фосфотирозина и хроматографии на лектине, мы определили, что c-Met является основным белком цитоплазматической мембраны, который реагирует на изменения pH. Активация c-Met щелочной средой происходит при pH> 8,0 и является дозозависимой. Специфичность ответа c-Met подтверждена обработкой ингибитором SU11274, а также нокаутом рецептора c-Met с использованием системы редактирования генома CRISPR / CAS9.