Поиск Кабинет

Лечение серповидно-клеточной анемии комбинацией методов генной терапии и РНК-интерференции

Явление РНК-интерференции (RNA interference) было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК у C. elegans. Термин «РНК-интерференция» (iRNA) для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire в 1998 году [1, 2]. РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК) (рис.).

РНК-интерференция уже широко изучается с терапевтической целью, например, для подавления экспрессии вирусных генов, онкогенов или специфических генов, вызывающих заболевания [3]. Достоинства этого метода - высокая специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой двухцепочечной РНК); высокая эффективность (экспрессия гена подавляется более чем на 90%, несколько десятков молекул двунитевой РНК могут привести к деградации нескольких тысяч молекул РНК-мишени).

Пока терапевтическое использование РНК-интерферен-ции ограничено, во-первых, жесткими условиями выбора гена, работу которого надо подавить, во-вторых, индукцией ответа иммунной системы на экзогенную РНК, которая может привести к полному подавлению синтеза белка и апоп-тозу [4, 5]. Регуляция синтеза siRNA в определенное время и в определенных клетках позволит минимизировать возможное повреждающее действие РНК-интерференции. Применение РНК-интерференции в клеточной терапии требует точного, высокоспецифичного определения гена, играющего главную роль в развитии заболевания, так как РНК-интерференция заставляет этот ген «замолчать».

Ученые из Sloan-Kettering Institute (New York, NY, USA) впервые показали возможность использования РНК-интер-ференции вместе с трансгенезом при лечении серповидноклеточной анемии (СКА).

Причина СКА заключается в однонуклеотидной замене урацила на аденин, в результате чего синтезируется цепь молекулы глобина с глютамином, вместо валина. Замена одной аминокислоты оказывается достаточной, чтобы изменить функциональные свойства гемоглобина (пониженная растворимость, повышенная полимеризация). При этом гемоглобин уже не может выполнять кислородакцепторную функцию и кристаллизуется при недостатке кислорода, а эритроциты приобретают серповидную форму, склеиваются, тромбируют капилляры и т. д. Мутантный ген получил название ns, в отличие от нормального п-глобина На первом этапе эксперимента, авторы закодировали в интрон п-глобинового гена шпильку РНК (small hairpin RNA, shRNA), которая позволяет построить малые интерферирующие РНК (small interfering RNA, siRNA), комплементарные гену-мишени. Совместная экспрессия гена и siRNA позволяет специфически подавлять уровень транскриптов гена-мишени для siRNA строго в определенных клетках и на определенной стадии. Положение shRNA в интроне позволяет достигнуть синхронного уровня экспрессии экзогена и siRNA.

По расчёту учёных, трансфекция гемопоэтических стволовых клеток с мутацией □> os, приводящей к развитию СКА, должна привести к транскрипции п-глобина с одновременной редукцией экспрессии ns-глобина - белка, ответственного за возникновение этой болезни.

Для исследования возможности использования этого метода в терапии ученые выбрали гены, экспрессирующиеся в клетках эритролейкемии крысы (murine erythroleukemia, MEL): green fluorescent protein (GFP) и murine п-major (Mn). Клетки MEL были трансфецированы конструкцией с п-гло-бином и shRNA, а затем подвергнуты дифференцировке для запуска эндогенной экспрессии глобина.

В клетках, трансфецированных вектором, содержащим shRNA, комплементарную Мп, содержание транскриптов этого гена снизилось на 86% уже на шестой день после трансфекции. При трансфекции вектором с другой вставкой shRNA уровень транскрипции гена Mn не менялся, что доказывает высокую специфичность подавления экспрессии. В случае трансфекции клеток, экспрессирующих GFP белок, вектором с комплементарной вставкой, уровень флуоресценции тоже понижался на 85%. Это доказывает возможность избирательного, высокоспецифичного подавления экспрессии генов в определенное время. Также были показаны различия этого подавления в зависимости от положения вставки shRNA внутри интрона.

Известно, что введение экзогенной РНК вызывает иммунный ответ, а именно активацию системы интерферона [4, 5]. Авторы изучили иммунный ответ на трансфекцию созданной ими конструкции, а именно проанализировали уровень транскрипции генов, вовлеченных в систему интерферона. Выяснилось, что экспрессия этих генов увеличивается вместе с увеличением экспрессии вектора клонирования. Однако, при уменьшении размера транскрибируемой вставки, а также при некоторых положениях вставки shRNA, этот эффект уменьшается. Эти результаты можно учесть при применении РНК-интерференции in vivo.

Учёные трансфецировали человеческие гемопоэтичес-кие столовые клетки (CD34+) от здоровых людей (генотип □/□) и от пациентов - гомо- (ns/ns) и гетерозигот (n/ns) с СКА. После дифференцировки этих клеток, индуцированной эритропоэтином, подтвердилось строго специфичное снижение уровня транскриптов os, тогда как уровень п-глобина существенно не снизился. В то же время можно было детектировать транскрипцию гена п-глобина на сравнительно высоком уровне. Эти результаты показывают, что в клетках синхронно один транскрипт (ns) заменяется другим (п-глобин), за счет чего и достигается терапевтический эффект, так как фетальный п-глобин снижает уровень полимеризации ns-глобина в эритроцитах. Важным достоинством метода является возможность использования собственных клеток пациента, а не донорского материала.

Таким образом, авторы впервые показали осуществимость комбинированного терапевтического подхода генной и siRNA терапии на модели СКА с клетками человека. Терапевтические возможности РНК интерференции потенциально очень велики, несмотря на риск иммунного ответа и необходимость строгих условий выбора гена-мишени. В настоящее время ведутся работы по изучению транспорта РНК из клетки в клетку [6], опубликованы статьи об исследованиях РНК- интерференции в борьбе со СПИДом [7-9], гепатитом [10, 11] и раком [12-14]. Все это дает надежду на разработку нового, более эффективного метода (чем обычная генная или клеточная терапия) в биомедицине. Тем не менее, метод может иметь и ряд недостатков - нарушение естественного хода трансляции, иммунный ответ, неспецифическое подавление экспрессии [15, 16]. Несомненно, развитие этого перспективного метода поможет решить некоторые из этих проблем.

Подписаться на новости
788
Дата: 15 мая 2006 г.
© При копировании любых материалов сайта, ссылка на источник обязательна.
Подняться вверх сайта