Поиск Кабинет

Геномные изменения эмбриональных стволовых клеток человека при длительном культивировании

Подготовила B.C. Мелихова по материалам Nat. Genet. AOP; 4 September 2005; doi: 10.1038/ng 1631.

Известно, что при длительном культивировании клетки могут претерпевать значительные фено- и генотипические изменения. Как и все активно делящиеся в культуре клетки, эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСКч) претерпевают 10-9 спонтанных мутаций на нуклеотид. Ограниченные деления таких мутантов и работа репаративных ферментов позволяет поддержать практически неизменные свойства культуры в целом, если только речь не идет о мутациях, способствующих лучшему выживанию и влияющих на клеточное деление. В организме мутантные клетки элиминируются иммунной системой, однако в культуре этого не происходит.

В журнале Nature Genetics опубликованы результаты международного исследования геномных изменений в длительно поддерживаемых в культуре линий ЭСКч из регистра NIH. В предыдущих работах, в которых рассматривался вопрос генетической стабильности этих же линий,использовался кариотипический подход, в некоторых из них приводились данные об уникальной стабильности культивируемых долгое время [2 года) ЭСК [1 -3]. Однако в прошлом году, в Великобритании группой исследователей были установлены некоторые изменения кариотипа в линиях ЭСКч [4].

В данной работе приводится сравнение генотипов линий ЭСКч на ранних и поздних пассажах. Линии, зарегистрированные в NIH и доступные для исследований, были предоставлены компаниями ES Cell International, WiCell Institute, BresaGen, и Cellartis AB. Для анализа клеточного генома было использовано три различных подхода, независимо выявляющих изменения в клеточной ДНК:

- изучение количества копий ядерной ДНК (плоидность); - изучение митохондриальной ДНК; - уровень метилирования генных промоторов.

Всего было проанализировано 9 пар различных линий ЭСКч на различных сроках культивирования и одна непарная линия.

Для геномного анализа исследователи применили генные чипы Affymetrix GeneChip компании Affymetrix. Один такой чип позволяет выявлять полиморфизм единичных нуклеотидов 100 000 генов. Для каждого подхода применялся соответствующий чип. Для выявления изменений в плоидности был использован кит Affymetrix GeneChip Chromosome. Из девяти парных линий четыре (45%) имели явные изменения в количестве копий геномной ДНК на поздних пассажах. Эти изменения были различны - от амплификаций и делеций больших участков [как, например, полная амплификация 17q плеча), до менее заметных - таких, как 2Mb амплификация вблизи myc-онкогена. Данные, полученные при использовании генного чипирования, были подтверждены методикой FISH и количественной ПЦР. Важно отметить, что все эти изменения касались районов, имеющих отношения к различным типам рака.

Скрининг митохондриального генома показал, что в 22% случаев [две из 9 линий) на поздних пассажах присутствуют изменения нуклеотидной последовательности [мутации) митохондриальной ДНК.

Наконец, исследователи показали аберрации в метилировании ряда генов в ЭСКч. Метилирование этих же генов является эпигенетической характеристикой для некоторых видов опухолевых клеток, как показатель естественного клеточного старения. В целом, восемь из 9 линий ЭСК на поздних пассажах [55-59), по сравнению с ранними пассажами имели более высокий уровень метилирования генных промотеров (11-33).

Таким образом, при изучении генома поздних пассажей ЭСКч, 8 из 9 линий несли одно или несколько генетических изменений, некоторые из которых характерны для злокачественных трансформаций человеческих клеток. Так, изменения в плоидности наблюдались в 45% случаев, последовательности митохондриальной ДНК - в 22%, изменения в уровне метилирования генных промоторов -в 90%.

Линии ЭСКч, поддерживаемые in vitro, подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям, следовательно, нуждаются в тщательном мониторинге как во время культивирования, так и в детальном анализе при использовании in vivo и в клинических целях.

Приведенный в этой работе анализ является на сегодняшний день самым детальным и имеет более «высокое разрешение», чем все предыдущие методы исследования генотипа и кариотипа линий ЭСКч [5]. Весь набор методов, применяемых в предшествующих работах, не позволял комплексно и глубоко оценить геномные изменения клеток [1-3]. Поскольку этой международной группой были проанализированы линии из разных источников [из разных стран], исследование можно считать независимым и законченным.

Результаты предполагают применение универсального подхода сканирования клеточных геномов при помощи генных чипов. Основная заслуга в распространении такого подхода, безусловно, принадлежит компании Affymetrix, применение чипов которой становится своеобразным стандартом в клеточной и молекулярной биологии [5].

Таким образом, линии ЭСКч, поддерживаемые in vitro длительное время, подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям, а значит, нуждаются в тщательном геномном мониторинге как во время культивирования, так и в детальном анализе при использовании in vivo и тем более в клинических целях. Тем не менее, приведенные данные не дают информации о причинах генных аберраций. Авторы статьи призывают к более внимательному исследованию карио-и генотипа ЭСК на поздних пассажах. Применение линий ЭСК для модельных фармакологических экспериментов, прекли-нических и клинических испытаний в будущем, предполагает использование для этих целей клеток, прошедших минимальное количество пассажей в культуре.

Подписаться на новости
649
Дата: 04 сентября 2005 г.
© При копировании любых материалов сайта, ссылка на источник обязательна.
Подняться вверх сайта