Поиск Кабинет

Д.О. Жарков

Рецензия на монографию «Методы редактирования генов и геномов» под редакцией д. б. н., профессора С.М. Закияна, к. б. н. С.П. Медведева, к. б. н. Е.В. Дементьевой и академика РАН В.В. Власова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

 

D.O. Zharkov

Review of the monograph "Methods of editing genes and genomes" edited by S.M. Zakiyan, S.P. Medvedev, E.V. Dementiev and V.V. Vlasov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia

 

oxoguanine@gmail.com

 

В издательстве Сибирского отделения РАН вышла коллективная монография «Методы редактирования генов и геномов» под редакцией д. б. н., профессора С.М. Закияна, к. б. н. С.П. Медведева, к. б. н. Е.В. Дементьевой и академика РАН В.В. Власова [1]. В ней впервые собраны под одной обложкой описания многих протоколов, используемых в геномном редактировании – области, которая в наши дни развивается с головокружительной скоростью. Ее создатели Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна в 2020 г. были удостоены Нобелевской премии по химии.

Впервые редактирование генома как инструмент для модификации наследственного материала клеток высших эукариот, в том числе человека, вошло в арсенал генетических технологий в начале 1980-х годов, когда американские генетики Марио Капекки и Оливер Смитис показали возможность интеграции экзогенных последовательностей в хромосому за счет гомологичной рекомбинации и изобрели методы селекции стабильно трансформированных клеток [2, 3]. Этот подход лег в основу получения трансгенных животных, и с его помощью были получены тысячи линий мышей с нокаутированными генами, без которых трудно представить себе современную молекулярную биологию. Однако низкая эффективность трансформации, связанная прежде всего с проблемами адресации гомологичной рекомбинации к определенным сайтам в геноме, делала невозможным получение мутаций без селекции на чувствительность и устойчивость к антибиотикам, что не только усложняло получение мутаций, отличающихся от генных нокаутов, но и накладывало жесткие ограничения на использование этой технологии в медицине и сельском хозяйстве. Поэтому 1990-е–2000-е годы ознаменовались поиском новых, более эффективных методов адресации геномного редактирования. В это время появились подходы к адресации, основанные на использовании цинковых пальцев [4, 5] и TAL-эффекторных доменов [6] для узнавания определенных последовательностей в ДНК, также некоторое время в качестве многообещающих адресуемых редакторов рассматривались ферменты – мегануклеазы [7]. Хотя эффективность всех этих методов была выше, чем у традиционной технологии трансгенеза, их общим недостатком была необходимость получения нового адресующего белкового модуля для каждого нового сайта в геноме, что делало весь процесс крайне трудоемким. Поэтому появление технологии CRISPR/Cas9, сочетающей комплементарный принцип адресации с простым в обращении и эффективным белком-редактором, произвело настоящую революцию в геномных технологиях [8, 9]. В результате работы по направленному изменению генома самых разных организмов и широкого круга клеточных линий, которые ранее были ограничены лишь небольшим числом специализированных лабораторий, стали доступны практически любой группе, владеющей основными приемами молекулярной и клеточной биологии.

Книга «Методы редактирования генов и геномов» исключительно удачно продолжает начатую издательством СО РАН несколько лет назад серию монографий о геномном редактировании. В 2016 г. вышло издание «Редактирование генов и геномов», в котором впервые в России были сведены воедино основные сведения о всех существовавших на тот момент технологиях редактирования, их областях применения, проблемных вопросах и перспективах развития [10]. Второе издание 2018 г. было значительно переработано и расширено до трех томов [11]. Хотя область направленного изменения геномов развивается настолько быстро, что за два прошедших года появилось несколько новых технологий, основанных на системе CRISPR/Cas9, этот трехтомник остается самым полезным и авторитетным изданием о геномном редактировании на русском языке. Однако освоение современных методов и подходов настоятельно требует не только обзорных статей, освещающих их основные принципы, но и подробных описаний протоколов и регламентов работ, которых до настоящего времени в нашей стране не существовало. Новая книга решает именно эту проблему: наконец-то появился сборник, где в одном месте можно найти бóльшую часть лабораторных методик, необходимых для работы по внесению направленных изменений в геномы многих видов живых организмов. В число авторов входят ученые как из академических организаций, так и из биотехнологических компаний, представляющие Россию, Германию, Великобританию и Нидерланды.

Книга открывается разделом, посвященным биоинформатическим аспектам выбора мишеней для геномного редактирования. Эта сторона процесса редактирования критична для успеха проектов по внесению точных изменений в геном, поскольку правильный выбор мишени сильно влияет на возможность возникновения мутаций в нецелевых областях. К счастью, существует большое число программ, предназначенных для выбора целевых сайтов редактирования и конструирования направляющих РНК, и первая часть сборника поможет читателю в них ориентироваться.

Большая часть протоколов, описанных в книге, посвящена деталям редактирования клеток конкретных организмов. Широкий спектр биологических видов, который покрывается сборником, представляет особую ценность. В число объектов геномного редактирования, методы для которых представлены в книге, входят как привычные экспериментальные модели – Arabidopsis, дрозофила, грызуны (мыши и крысы), клетки человека, так и не столь часто встречающиеся в лаборатории дрожжи Debaryomyces hansenii, плоские черви Macrostomum lignano и два вида картофеля. Человеческим клеткам уделено больше всего внимания, что не удивительно в свете все более широкого использования клеточных линий с точными генетическими изменениями в персонализированной медицине. В частности, описаны методы получения клеточных моделей хореи Гентингтона и болезни Паркинсона, которые будут полезны для скрининга потенциальных лекарств против этих патологий. Не меньшую роль играет редактирование генома человека и в фундаментальных исследованиях клеточных процессов; в сборнике приведены как примеры таких работ (получение нокаутных линий для исследований ответа на гипоксию и репликации ретровирусов), так и описания универсальных платформ для них (интеграция генов-репортеров и генов, кодирующих направляемые нуклеазы, работа с нокаутными библиотеками). Несколько глав на примерах клеточных линий, первичных клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток описывают общие принципы и протоколы сборки генетических конструкций для редактирования, методы скрининга и селекции редактированных клеток. Значительную ценность представляют описания «подводных камней», с которыми исследователи нередко сталкиваются даже на стадии планирования экспериментов – в частности, освещены проблемы, связанные с анеуплоидным генотипом многих клеточных линий, и приведен элегантный пример специфичного редактирования одного из аллелей при наличии паралогичных генов.

Наконец, заключительные главы более подробно описывают протоколы получения необходимых молекулярных инструментов, предназначенных как непосредственно для геномного редактирования, так и для фундаментальных исследований механизмов действия этих систем. Освещены методы синтеза направляющих РНК, в том числе несущих химические модификации для увеличения их эффективности, сборки химически модифицированных ДНК-субстратов для изучения ферментов редактирования, а также методы получения рекомбинантных вирусных векторов для направленного изменения генома.

Сборник качественно издан в твердом переплете, снабжен цветными иллюстрациями, схемами рабочих процессов и примерами документированных результатов экспериментов. Хочется надеяться, что он найдет свое место не на книжных полках, а на рабочих столах в десятках лабораторий по всей России.

 

ЛИТЕРАТУРА:

  1. Методы редактирования генов и геномов. С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, В.В. Власов. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2020.
  2. Thomas K.R., Folger K.R., Capecchi M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell 1986; 44: 419-28.
  3. Doetschman T., Gregg R.G., Maeda N. et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 1987; 330: 576-8.
  4. Klug A. The discovery of zinc fingers and their applications in gene regulation and genome manipulation. Annu. Rev. Biochem. 2010; 79: 213-31.
  5. Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 2010; 11: 636-46.
  6. Joung J.K., Sander J.D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2013; 14: 49-55.
  7. Silva G., Poirot L., Galetto R. et al. Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: Perspectives and challenges for gene therapy. Curr. Gene Ther. 2011; 11: 11-27.
  8. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337: 816-21.
  9. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339: 819-23.
  10. Редактирование генов и геномов. Отв. ред. С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, В.В. Власов. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2016.
  11. Редактирование генов и геномов: в 3-х т. Отв. ред. С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, Е.А. Покушалов, В.В. Власов. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2018.

Подписаться на новости
8348
Дата: 10 февраля 2021 г.
© При копировании любых материалов сайта, ссылка на источник обязательна.
Подняться вверх сайта