Поиск Кабинет

Плацента человека как источник гемопоэтических стволовых клеток

Гены & Клетки: Том III, №2, 2008 год, стр.: 51-56

 

Авторы

Сериков В.Б., Куйперс Ф.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время лишь часть пациентов, нуждающихся в трансплантации гемопоэтических стволовьх клеток, имеет возможность получить иммунологически совместимый материал. Источниками гемопоэтических стволовьх клеток являются костный мозг, периферическая и пуповинная кровь. Хотя гемопоэтические стволовые клетки пуповиной крови имеют много преимуществ, их количество в доступном объеме пуповинной крови недостаточно для трансплантации взрослому человеку. В данной работе мы сообщаем, что ткань зрелой плаценты человека содержит большое количество гемопоэтических стволовых клеток, которые не связаны непосредственно с кровообращением плода или матери. Количество этих гемопоэтических стволовых клеток в целой плаценте в 10 раз превышает их количество в доступном объеме пуповинной крови. Гемопоэтические стволовые клетки, полученные из свежей или криоконсер-вированной плаценты, дифференцируются в клетки эритроидного и миелоидного ростков как in vitro, так и in vivo при трансплантации иммунодефицитным мышам. Таким образом, криоконсервирован-ная плацента может служить потенциальным источником для замещения пула гемопопоэтических стволовых клеток у человека.

Введение

Плацента - провизорный орган, осуществляющий связь между организмом матери и плодом в процессе внутриутробного развития. Помимо выполнения известных фундаментальных функций, плацента млекопитающих представляет собой богатый резервуар гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). В процессе онтогенеза происходит миграция очагов гемопоэза. К настоящему времени наиболее детально исследованы процессы плацентарного гемопоэза у мышей, который во многих отношениях может служить моделью кроветворения у человека.

У мыши эмбриональный гемопоэз начинается после гаст-руляции, когда группа специализированных мезодермальных клеток-предшественников (гемангиобластов) коммитируется на путь гемопоэза. Первые кроветворные предшественники мигрируют в стенку желточного мешка и инициируют продукцию эмбриональных «красных кровяных телец». Существуют данные, что дефинитивные ГСК, возможно, происходят из другой группы мезодермальных клеток [1]. Множество исследований свидетельствует о том, что мезенхима участка эмбриона, обозначаемого как «аорта-го-нады-мезонефрос» (АГМ), который ограничен дорзальной аортой и урогенитальными гребнями, является источником ГСК [2-5]. Дополнительно ГСК формируются в пуповинной и вителлиновой артериях [6]. Эти ГСК, вероятно, колонизируют развивающуюся печень, которая служит основным органом кроветворения уже в плодном периоде. Несмотря на прогресс в идентификации ГСК в зародышевых органах, до сих пор мало известно о происхождении различных пулов ГСК и их относительном вкладе в гемопоэз. Так, до 2003 года оставалось не выясненным, являются ли клетки АГМ единственным источником быстро растущего пула ГСК фетальной печени [7]. Новые перспективы в решении этого вопроса появились в связи с обнаружением в мышиной плаценте на средних сроках гестации многочисленных мульти-потентных клеток-предшественников и ГСК, что указывает на важную роль плаценты в становлении гемопоэза [8-10]. Еще в 70-е годы XX века было показано, что предшественники В-клеток появляются в плаценте мыши перед тем как попасть в печень [11]. Клетки, обладающие способностью генерировать В-лимфоциты, обнаруживались в плаценте на стадии Э9.5, их число достигало максимума на Э12.5 и затем снижалось, аналогичную кинетику демонстрировала и популяция ГСК [9]. Так, к концу внутриутробного развития количество ГСК в плаценте у мышей снижается, что, возможно, является отражением процесса миграции плацентарных ГСК в печень и другие развивающиеся кроветворные органы плода [тимус, селезенку и костный мозг). Накопленные данные позволяют предположить, что плацента может функционировать как орган лимфо- и миелопоэза.

Цель нашего исследования состояла в оценке человеческой плаценты как потенциально возможного источника ГСК в процессе естественного гемопоэза.

Материал и методы

Зрелые плаценты человека были получены в Госпитале Альта Бэйтс (Бэркли, Калифорния, США) с согласия доноров. Иммуногистохимические исследования тканей плаценты на присутствие CD34 и других маркеров ГСК -CD90, CD38, CD133 проводили на срезах с парафиновых блоков, методом иммунофлюоресценции после обработки протеиназой К. На первом этапе проводили перфузию плацент через артерии и вену пупочного канатика раствором антикоагулянта и сосудорасширяющего агента. Далее, для выделения клеток, в артериальное русло вводили 50 мл физиологического раствора на фосфатном буфере с антибиотиками [пенициллин, стрептомицин и фунгизон), протеазами (дис-паза (2,5 ед./мл), трипсин (0,5 мг/мл)) и ЭДТА. Образцы тканей плаценты измельчали и помещали в буфер с колла-геназой I (0,1%) и диспазой (2,5 ед./мл) на 30 мин при 37°C. Полученные таким образом образцы перемешивали и фильтровали через фильтр с размером пор 100 мкм в течение 5 мин.

Для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК), тканевый лизат центрифугировали при 400g в течение 1 5 мин., удаляли супернатант. Культивирование проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [12].

Часть плацент криоконсервировали по следующей схеме. Плаценты промывали 250 мл буферного раствора (см. выше), затем проводили перфузию раствором смеси криоконсервантов (пропилен гликоль (15%), DMSO (14%), Formamide (14%) и др. в течение 40 мин. Затем плаценты замораживали в морозильной камере (-80°С) в течение 12 часов, после чего помещали в жидкий азот.

Количество CD34+ клеток в гомогенахы тканей определяли с помощью проточного цитофлюориметра FACScaliber (BD Bioscences, San Jose, CA) с использованием Procount Progenitor Cell Enumeration Kit (BD Bioscences). Выделяли CD34/CD45 положительную популяцию клеток. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ядерно-цитоплазматического окрашивания To-Pro.

Дифференцировочный потенциал клеток оценивали с использованием полной среды MethoCult® на основе ме-тилцеллюлозы (Stem Cell Technologies, Canada). Присутствие клеток-инициаторов долговременно поддерживающихся культур определяли с использованием фидерного слоя из стромальных клеток плацентарного происхождения от того же донора. Для инактивации фидера культуру обрабатывали раствором митомицина С (10 мкг/мл) (Sigma, St.Louis, MO) в течение 2 часов.

В экспериментах с трансплантацией полученных клеток использовали иммунодефицитных мышей двух линий (Jaxon Laboratories, Bar Harbor, Maine): необлученных NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (JaxLab Cat. № 005557) и целиком облученных (2,5 Gy) NOD.Cg-Rag1tm1Mom Prf1tm1Sdz/Sz (JaxLab Cat. № 004848). Всем мышам внутрибрюшинно вводили 106 ядросодержащих клеток, выделенных из плацентарных тканей. Через 2-3 мес. после трансплантации животных выводили из опыта и производили иммуноокрашивание клеток крови, костного мозга и селезенки антителами к человеческим CD45 (общий лейкоцитарный маркер), CD3 (лимфоцитарный маркер), CD25 (лимфоцитарно/моноци-тарный маркер) и CD51/CD61 (маркеры тромбоцитов/ мегакариоцитов). Подсчет клеток проводили с помощью проточной цитометрии с использованием соответствующих негативных (мыши без трансплантации) и позитивных конт-ролей (человеческая кровь).

Результаты

В исследовании мы уделили основное внимание двум классическим маркерам человеческих ГСК: CD133 и CD34. Известно, что примитивные ГСК, гемопоэтические клетки-предшественники и гемангиобласты экспрессируют CD133. CD133+ клетки костного мозга эффективно заселяются в ткани иммунодефицитных мышей, и эта популяция CD133+ ГСК содержит предшественники гранулоцитов/макрофагов. Популяция CD133+ в костном мозге и крови коэкспрессирует CD34. У человека колониеформирующая активность характерна для популяции CD34+ клеток, которые способны к колонизации и репопуляции кроветворных органов иммуннодефицитных мышей. Популяция CD34+ клеток костного мозга содержит ГСК, которые поддерживают гемопоэз в течение всей жизни организма.

Иммуногистохимическое исследование тканей плаценты показало присутствие многочисленных кластеров CD34+ клеток, не связанных с микроциркуляторным руслом, локализованных в свободной соединительной ткани (рис. 1). Количество CD34+ клеток составляло 0,2±0,03% всех клеток плаценты, их общее число в среднем составляло 2,5х107 клеток на плаценту. Была отмечена колокализация CD34 и других классических маркеров ГСК - CD90, CD38, CD133 (см. рис. 1).

Сравнительный анализ пуповинной крови и препаратов, полученных после обработки плаценты протеолитическими ферментами, показал гораздо более высокий выход живых, CD45dimCD34+ клеток из плаценты. Общее количество ГСК, доступных в препарате плаценты, по сравнению с общим объемом пуповинной крови из этого же источника, было в среднем в 10-12 раз выше (см. рис. 1).

Иммуногистохимическое исследование также показало присутствие многочисленных кластеров CD133+ клеток, локализованных в свободной соединительной ткани (рис. 2). Cреди этих кластеров выявлялись очаги эритро-поза.

Гистологические и цитометрические данные свидетельствуют о том, что плацента является очень богатым источником CD34+ и CD133+ ГСК. Для того, чтобы убедиться в жизнеспособности и дифференцировке ГСК после обработки ткани протеиназами, мы оценили способность клеток к дифференцировке в клетки крови, используя стандартные тесты на колониеобразование, включая СFU-E, BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM, результаты сравнивались с такими же тестами в отношении ГСК пуповинной крови. Между числом колоний, образованных одинаковым количеством клеток плаценты или клеток пуповинной крови из той же плаценты, не было выявлено статистически значимой разницы. Клетки, растущие в MethoCult® в течение 14 дней, были позитивны в отношении гемоглобина, CD45, CD25, CD31 (маркера В-лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов), CD11b (маркера моноцитов и гранулоцитов) и CD69 (маркера макрофагов) (рис. 3).

Для того, чтобы показать присутствие среди первичных плацентарных клеток клеток-иниицирующих долговременную гемопоэтическую культуру, первичные плацентарные клетки культивировали в течение 6 нед. на фидерном слое из стромальных клеток, выделенных из тех же образцов плаценты. В этом случае ГСК активно дифференцировались в среде MethoCult®, что доказывало присутствие клеток-инициаторов долговременной культуры среди первичных плацентарных клеток.

У иммунодефицитных мышей NOD/SCID, получивших сублетальную дозу облучения, введение плацентарных CD34+ ГСК приводило к появлению в костном мозге, селезенке и периферической крови CD45+CD3+ лимфоцитов. Химеризм (присутствие человеческих клеток крови) достигал 9-12%, составляя в среднем 3±1%. Наблюдалось присутствие CD45+CD29+ клеток, а также CD45+CD51+/ CD69+ клеток.

Аналогичные исследования после криоконсервации плацент и хранения в течение 1-3 мес. показали сходные результаты. Удалось получить такое же количество жизнеспособных CD34+ клеток, сохранивших способность к дифференцировке.

Обсуждение

Полученные результаты показывают, что плацента человека содержит чрезвычайно большое количество гемопоэ-тических клеток-предшественников. Из плацентарных тканей человека можно получить большее количество CD34+ ГСК, чем из пуповинной крови. Эти клетки сохраняют свои способности к прогрессивной дифференцировке по пути лимфо- и миелопоэза после криоконсервации.

В некоторых исследованиях на мышах показано, что плацента в 2-4 раза богаче ГСК, чем даже фетальная печень [8, 13]. На стадии Э9 и Э10 в плаценте уже присутствовали ГСК, в то время как в печени их еще не было.

Особенностью плацентарных ГСК является быстрое увеличение их численности в период между Э11.5 и Э12.5 [9]. В результате чего в этот период содержание ГСК в плаценте более чем в 15 раз превышает численность ГСК в АГМ или в желточном мешке, что, возможно, говорит об уникальном кроветворном микроокружении, которое существует в плаценте. Увеличение пула ГСК в период Э11.5-Э12.5 было более выраженным, чем увеличение соответствующего пула клоногенных клеток-предшественников, что свидетельствует о том, что плацентарное микроокружение способствует поддержанию ГСК без одновременной дифференцировки в последующие кроветворные классы [9]. Количество гемо-поэтических клеток в плаценте на средних сроках гестации (соответствующих примерно 1-2 месяцам гестационного возраста человеческого эмбриона) во много раз превосходит их количество в зрелой плаценте, пуповинной крови и циркулирующей крови in toto. Данные результаты показывают, что плацента является ранее недооцененным источником ГСК.

В настоящее время основными источниками ГСК для трансплантации в клинической практике служат костный мозг, периферическая и пуповинная кровь. Но потребность в HLA-совместимых стволовых и прогениторных кроветворных клетках превышает возможность по их заготовке. Менее чем 30% потенциальных реципиентов имеют HLA-идентичных родственников, в связи с чем широко распространенной является пересадка аллогенных ГСК костного мозга, которая часто приводит к неблагоприятным реакциям со стороны иммунной системы. Кроме того, не следует забывать и о главном ограничении использования человеческой пуповинной крови для трансплантации - низкое содержание в ней ГСК, недостаточное для обеспечения адекватного восстановления гемопоэза у взрослых реципиентов [14].

Результаты нашей работы с очевидностью показывают, что криоконсервирование плаценты с помощью перфузии и последующего замораживания может являться альтернативным и эффективным способом сохранения аутогенных кроветворных стволовых клеток в количестве, достаточном для реконституции гемопоэза взрослых пациентов.

Подняться вверх сайта