Поиск Кабинет

На пути к расшифровке кодов эмбриональных стволовых клеток

Гены & Клетки: Том III, №2, 2008 год, стр.: 30-37

 

Авторы

Репин B.C., Сабурина И.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

B обзоре представлен оригинальный авторский анализ накопившейся информации о факторах регуляции плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток.

После завершения программы «Геном человека», открытия регуляторной ДНК и цис-регуляторного кода на повестку дня вышел вопрос вопросов: каким образом регуляторная информация («углеродные мегабайты») управляет «молекулярными машинами» и внутриклеточными механизмами соматических клеток? В соматических «клетках-автоматах» сигнальные регуляторные системы определяют: 1) химический гомеостазис; 2) объемы и амплитуды физиологической функции. В отличие от большинства клеток взрослого организма, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) предоставляют в руки экспериментатора живой «микропроцессор», серийный множитель soft-программ в виде клона клеток. ЭСК по затратам энергии сопоставимы с клетками головного мозга и кишечника. Однако 90% всех белков ЭСК - это компоненты регуляторных сетей. 90% всей РНК в ЭСК - это мРНК регуляторных генов, иРНК - первичные триггеры раннего эмбриогенеза и селекторы соматических линий, РНК - регуляторы хроматина, компоненты молчащих - «дормантных» молекулярных структур в резервных стволовых клетках.

Где хранятся и накапливаются регуляторные мегабайты, как идентифицировать soft-материю в клетках? Электронный микроскоп не выявил принципиальных отличий в организации обычных соматических и стволовых клеток. Все стволовые клетки (СК) имеют более примитивный (минимальный) фенотип с меньшей плотностью элементов цитоскелета и органелл, отвечающих за специализацию клетки. Однако in vitro можно заставить «забыть» ЭСК свое прошлое и место организме. Вне организма в культуре над фидером ЭСК серийно копируют гены и программы эмбриогенеза в виде инфо-сырья на будущее. Сейчас разработаны методы серийного клонирования ЭСК в простых суспензионных средах или на малоадгезивном матриксе (гидрогель или MatrigelTM). Наработка любого сырья из ЭСК опирается на два свойства - плюрипотентность и самообновление.

Что такое плюрипотентность (ПП) ЭСК на языке измерений?

Описать феномен плюрипотентности можно в виде набора обязательных свойств.

1. Характерный рост плотными эпителиоидными колониями на подложке или в виде 3D-сфер над фидером.

2. Наличие около 100 генов и молекулярных маркеров, экспрессирующихся только в незрелых пролиферирующих клонах ЭСК. Эти белки-маркеры не найдены в соматических клетках плода или взрослого организма.

3. По закону антагонизма генов в развитии, в ЭСК нет белков зародышевых листков и клеток взрослых тканей. Гены ПП облигатно выключены во всех соматических клетках.

4. При введении в бластоцисту, ЭСК соучаствуют в развитии, встраиваясь в ткани зародыша; они в 100% ту-морогенны при введении в ткани взрослого организма; в 40-70% туморогенны при ведении в постимплантацион-ные зародыши.

5. Экстраэмбриональные ткани индуцируют ускоренную дифференировку ЭСК в соматические линии через промежуточное образование зародышевых листков и аксиальный паттернинг.

6. В простых средах и при добавлении химических индукторов ЭСК дифференцируются в линии соматических клеток в обход зародышевых листков, не демонстрируя аксиального развития и органогенеза.

7. Плюрипотентные 3D-сферы или 2D-колонии не продуцируют собственного матрикса. Первый матрикс в сферах вырабатывают клетки примитивной висцеральной энтодермы. Кавитация запускает вторичную индукцию мезодермы и кардиомиоцитов. В настоящее время разработан арсенал матриксов, на которых ЭСК животных и человека сохраняют ПП и способность к самообновлению.

Пути расшифровки кодов ЭСК

Молекулярные биологи первыми попытались отыскать простые молекулярные «отмычки» для объяснения феномена плюрипотентности. Многие лаборатории делали замеры спектра мРНК в недифференцированных ЭСК; сравнивали полученные данные с показателями клеток, вступивших в дифференцировку. Разные схемы сопоставления профиля мРНК/белов ПП-ЭСК и клеток прогениторов-дериватов привели к идентификации 109 генов плюрипотености, которые в дальнейшем разделили на 4 подгруппы [1-3]. Установлено, что «выключение» плюрипотентности происходит в течение 17-72 часов после запуска дифференци-ровки. Методические трудности были связаны с тем, что только первые 20 белков ПП находились в клетках в высокой концентрации. 80% белков оказались на грани порога детекции. Увеличение численности анализируемых клеток вело к нарастанию гетерогенности РНК и белков из-за неизбежной неоднородности биоматериала. Как уже много раз бывало в молекулярной биологии, анализ списка белков из «клуба плюрипотентности» мало что подсказал относительно молекулярного кода ПП-сети. [таб. 1). Полученные «снизу» данные не проливают свет на то, как система регуляторов работает на уровне хроматина и выходного поведения клеток.

На основании каталога генов ПП комиссия международных экспертов предложила «канонизировать» 17 поверхностных антигенов и 90 генов ПП для паспортизации выделяемых линий ЭСК [4]. Молекулярная биология сделала свое дело: предложила надежные маркеры для выделения однородных клеток.

Сопоставление 2D-npoTeoMHbix карт всех известных ЭСК по тому же принципу выявило 92 белка. Сопоставление 2D-протеомных карт незрелых ЭСК и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) привело к идентификации 52 общих белков, соучаствующих в сети ПП [39]. Однако найти общий функциональный смысл работы этой весьма гетерогенной группы белков пока не удалось. Oct4, Nanog, Sox2 и другие белки сети ПП-ЭСК не найдены в ядре эпителиальных региональных СК и региональных МСК [40]. Напомним, что функции 40% генов, работающих в ЭСК человека и млекопитающих, ещё не установлены.

Ясно, что плюрипотентность ЭСК не сводима только к набору молекулярных маркеров или профилю выходных физиологических реакций. Скорее, плюрипотентность можно определить паттернами поведения ЭСК, которое управляется эпигенетическими сигналами. Корпоративный молекулярный подход позволяет лучше понять сетевую организацию плюрипотентности ЭСК. Центральное ядро из ключевых генов плюрипотентности окружено сетью из сигнальных белков-агонистов и сигнальных белков-антагонистов (Brachyury, Dkk1, HLX1, GATA6, ID2, Dlx5). Сигнальная сеть из белков-антагонистов с входной стороны связана с основными потоками дифференцировочных сигналов, поступающих через 4 главных пути: Wnt-, Activin/Nodal-, BMP- и FGF-каскады. Эффекторной частью сеть антагонистов связана с ядром плюрипотентных генов. Поэтому с помощью сети агонистов/ антагонистов главная программа плюрипотентности получает шкалу «тонкой настройки» [41]. Если начальные ЭСК имеют индивидуальный фенотип и профиль ключевых генов ПП, то разные клоны и регенерационные модули на базе одиночных ЭСК имеют «корпоративный» фенотип. Поэтому характеристики линий ЭСК, отдельных клеток и клеточных модулей должны существенно различаться.

Новые функциональные признаки «клуба белков плюри-потентности» приоткрылись на стыке анализа сиквенсов промоторов и взаимодействующих с ними регуляторных белков (методом иммунопреципитации на ДНК). Оказалось, что главные белки плюрипотентности Oct4, Nanog и Sox2 в ЭСК человека связаны соответственно с промоторами 523, 1271 и 1687 генов. В мышиных ЭСК Oct4 и Nanog связаны с 1083 и 3000 генами развития соответственно (включая транскрипционные факторы) [42]. Интересно, что 353 гена развития связывали по промоторам сразу весь комплекс Oct4/Nanog/Sox2. Половина генов активируется комплексом Oct4/Nanog/Sox2, остальные остаются под стабильной репрессией. Среди активированных генов имеются кластеры Wnt- и TGFp-сигнальных каскадов. Высокий уровень бел- индуцирует репрессию их синтеза. Изучение функций геновков ПП регулируется множественными петлями обратной из «клуба плюрипотентности» с помощью техники нокаут и положительной и отрицательной связи [8]. Например, незна- нокдаун позволило в первом приближении оценить вклад чительное повышение уровня Sox2, Oct4 или Nanog белков отдельных генов [табл. 2).

Регуляторные РНК и плюрипотентность В ЭСК и ранних зародышах идентифицировано 20 00040 000 иРНК, контролирующих включение и/или выключение разных групп генов раннего и позднего эмбриогенеза [43]. Часть иРНК контролирует компактную упаковку гетерохроматина [44]. Избыток регуляторных РНК, контролирующих осевой паттернинг, органогенез, коммитиро-вание соматических линий позволяет использовать эти сигналы без остановки пролиферации клеток и «на ходу» реструктурировать хроматин в делящихся клетках. Молекулярным инструментом эмбриональной индукции, либо сигнальных «диалогов» между зародышем и экстраэмб-риональными тканями служат так называемые секреторные микровезикулы, нафаршированные регуляторными мРНК и иРНК [45]. Например, супрессия Oct4 в ЭСК с помощью се- лективной иРНК, индуцирует селективную экспрессию Cdx2, Hand1, PL-1 и других генов трофэктодермы с образованием характерных гигантских клеток трофобласта. Направленное иРНК выключение Nanog в ЭСК индуцирует образование экстраэмбриональной энтодермы и экспрессию её ключевых генов [GATA-4, GATA-6, ламинин В1). С помощью микровезикул, изолированных из ЭСК, кроветворные стволовые клетки удалось репрограммировать в Oct4+ Nanog+ Rex-1+ плюрипотентные клетки [45].

Например, полное подавление активности мРНК гена Oct4 приводит к автоматическому запуску экспрессии гена Cdx2 и дифференцировке трофэктодермы и трофобласта из ЭСК. Пятидесятипроцентное выключение активности мРНК Oct4 в тех же клетках индуцирует образование энтодермы с экспрессией GATA-4/GATA-6/Sox-17 [46].

Плюрипотентность и хроматин

Геном человека, включающий 35 000 генов и 3,2 млрд азотистых оснований, подвергается 400 000 кратной микроупаковке, чтобы уместиться в клеточном ядре. Как упакованы 2% «смысла» среди 98% бессмысленной цепочки длиной 2 метра в клеточном ядре? [47]. Ядро обычной интерфазной соматической клетки компартментализова-но на функциональные модули - ядерные поры, гетеро- и эухроматин, белковые тела, фибриллы и комплексы, петли хроматина, фабрики транскрипционных факторов, регуляторные модули супрессии и активации генов, межхромосомные комплексы. Специальные исследования под конфокальным микроскопом показали, что хроматин плюрипотентных ЭСК содержит мeнее компактные территории эухроматина и более диффузные области гетерохроматина [48, 49]. Одновременно все модули хроматина организованы более пластично и динамично.

Как правило, периферия ядра соматических клеток лишена эухроматина, тогда как наиболее активная часть петель хроматина локализована внутри сердцевины ядра [50]. Стабильно «дормантные» гены собраны около центромерной ДНК. Градиент эухроматина/гетерохроматина менее выражен в ядрах ЭСК за счет нарастания факультативного гетерохроматина. Конститутивный хроматин, как известно, маркируется метилированными 7-лизинами в H3 гистонах. Метилирование ДНК и гистонов в плюрипотентных клетках передается новым поколениям клеток (эпигенетическая память). Используя флуоресцентно меченые гистоны Н2В и Н3, обнаружена их повышенная мобильность и обмениваемость в гетерохроматине ЭСК [51].

Хроматин стволовых клеток полностью репрессирует все гены раннего, позднего эмбриогенеза и дифферен-цировки всех клеточных линий. В активном состоянии находятся гены, участвующие в самообновлении плюрипо-тентных клеток.

Главной особенностью плюрипотентных ЭСК считают гипердинамическую («дышащую») организацию хроматина, основанную на рыхлых контактах гистонов и главных транскрипционных комплексов с фибриллами и матриксом [51, 52].

В самое последнее время удалось установить первые прямые молекулярные маркеры состояния хроматина в эмбриональных стволовых клетках, некоторых региональных стволовых клетках (нейральных стволовых клетках, НСК) и соматических клетках (фибробластах). Оказалось, что карты триметилированных лизинов в гистонах существенно отличаются в ЭСК, НСК и фетальных фибробластах [53]. 90% промоторов в хроматине ЭСК маркировались триметилиро-ванным 4-лизином гистона Н3 (что характерно для неактивного хроматина дормантных локусов). Другой вариант неактивного хроматина - это триметилированный 27-й лизин гистона H3. Активные зоны хроматина имеют Н3 гис-тон, ацетилированный по 9-му лизину и метилированный по 4-му лизину [54].

Клон ЭСК как строительный модуль

Каждый клон ЭСК представляет естественный мост между отдельной клеткой и регенерационной тканью, между индивидуальным и корпоративным фенотипом, между индивидуальным и корпоративным поведением клеток. Все эпителиальные региональные стволовые клетки делятся асимметрично. Если истинные стволовые клетки контролируют численность первого поколения прогениторов, то потомство прогениторных клеток контролирует занимаемую территорию и обновление клеток на этой территории. Клетки приходят и уходят, но контролируемые территории остаются.

Современная геномика и протеомика позволяет очертить этот переход от плюрипотентности и самообновления к мезо-энтодерме или экстраэмбриональным тканям. Новообразованная зародышевая эмбриональная ткань оснащена набором наиболее известных лигандов/рецепторов, TGFp-, Wnt-, BMP-, FGF-сигнальными каскадами. Новые гены зародышевых листков и сигнальных каскадов автоматически выключают «ядро» из 109 генов плюрипотент-ности и самообновления [55-57]. Эмпирически было найдено, что тандем Oct4-Sox2 кооперативно активирует экспрессию FGF4 и UTF1 [58]. Тандем белков Oct4/FoxD3 связывается и активирует промотер остеопонтина и одновременно блокирует экспрессию генов энтодермы FoxA1/ FoxA2 [38]. LIF/Stat3 сигнальный каскад и синхронная экспрессия CD9 рецептора-тетраспанина облигатно связаны с плюрипотентностью/самообновлением ЭСК мыши; в ЭСК человека эта связь не установлена [58, 59]. Это объясняется тем, что LIF/Stat3 каскад активирует высокий myc в цитоплазме ЭСК именно мыши [60].

Антагонизм в экспрессии Oct4 и Cdx2 регулирует пропорцию ЭСК и трофэктодермы в культуре [61, 62]. Высокий уровень Oct4/Sox2/Nanog белков в хроматине линейно коррелирует с уровнем Е-кадгерина в плазматической мембране и эпителиальным статусом ЭСК [2].

Избирательное выключение Oct4 с помощью иРНК приводит к изменению экспрессии более 1000 генов в ЭСК человека [41]. Активируется экспрессия Cdx2/Eomes, хотя появление клеток трофобласта не было верифицировано под микроскопом. Одновременное подавление экспрессии Nanog, Sox2, Rex1, LeftA, LeftB, DPPA4, Zic3, Thy1, TDGF1, PRDM14 сочеталось с активацией экспрессии генов мезо-эндодермы (Brahyury, Tbx18, BMP4, Wnt, FGF/FGFR, activin, Notch, GATA-4, GATA6, Dkk, Id2, HLX1). Половина генов из группы репрессированных ИРНК анти- Oct4 были гены из «клуба плюрипотентности», связанные промоторной сетью с Nanog, Sox2, Rex1 и т.д. Селективное выключение Oct4 c помощью ИРНК вызывало сильную активацию экспрессии/ синтеза лизин-метилтрансферазы (H3-K4-HTT ase) гистонов, а также ацетилазы H2AFY/H2AFY2, деацетилазы HDAC6. Между тем экспрессия гистон-лизил-метил-трансферазы H3-K27-HMT-ase практически полностью подавлялась.

В модуле или клоне ЭСК работает закон антагонизма ведущих программ развития. Например, программа поддержания плюрипотентности исключает одновременный запуск дифференцировки, факторов транскрипции гаструлы и зародышевых листков. Закон антагонизма программ развития имеет огромное значение для понимания организации работы хроматина в ЭСК. Высокая экспрессия Oct4-Nanog-FoxD3 не только стабилизирует от помех модуль генов, ответственных за самообновление ЭСК. Одновременно эта сигнальная сеть мозаично снижает чувствительность клеток к индукторам дифференцировки [63]. Например, транскрипционный фактор Zic3 не только корпоративно держит «планку плюрипотентности», но и одновременно направленно поддерживает экспрессию Nanog на высоком уровне. Селективная иРНК против Zic3, избирательно снижая уровень Nanog в клетках, направленно смещает дифференцировку в сторону энтодермы.

В развитии работает закон клеточных сигнальных корпораций, которые с помощью синергизма/антагонизма программ намечают баланс территорий, предназначенных для разных путей развития.

Подняться вверх сайта