Поиск Кабинет

Морфохимическая характеристика спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии и трансплантации полимерного коллагенового нейроматрикса «Сферогель-Э»™ с инкорпорированными обкладочными нейроэпителиальными клетками

Гены & Клетки: Том III, №2, 2008 год, стр.: 57-62

 

Авторы

Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

С помощью гистологических и иммуногистохимических методов выявления GAP-43 и NF-200 исследованы тканевые перестройки и нейрохимические изменения в тканях рубца спинного мозга крыс, перенесших торакальную сегментэктомию с последующей трансплантацией обкладочных нейроэпителиальных клеток (ОНК), инкорпорированных в нейроматрикс «Сферогель-Э»™. Изменения в спинном мозге крыс контрольной группы на 1-2 неделе соответствует классическому варианту с формированием к 10-12 неделе плотной глиально-соединительнотканной капсулы. Пролиферативные процессы в спинном мозге экспериментальных животных начинаются в более ранние сроки, характеризуются меньшей выраженностью и особой архитектоникой глиальной реакции, активной пролиферацией соединительнотканных клеток и высоким уровнем макрофагальной активности. Сформированный рубец включает в себя большое число новообразованных капилляров и пучков нервных волокон, среди которых преобладают GAP-43- и NF-200-имму-нопозитивные элементы. Предполагается, что у животных экспериментальной группы изменение морфохимических свойств рубцовай ткани, замещающей дефект спинного мозга после его перерезки, обеспечивается: 1. модулирующей ролью коллагенового нейроматрикса; 2 - метаболической ролью трансплантированных ОНК, способных секретировать активные нейротрофические факторы, управляющие регенерацией и ремиелинизацией поврежденных нервных проводников.

Введение

Активное изучение репаративного потенциала стволовых клеток в настоящее время служит основанием для существенной корректировки некоторых аксиом классической неврологии, касающихся ограниченных возможностей нейрона к самовосстановлению. В этой связи в клинико-экспериментальной практике наблюдается отчетливая тенденция к отходу от традиционно пессимистической оценки реабилитационных возможностей больных с травмой спинного мозга [1, 2]. Известно, что основным препятствием на пути к клинически ценному восстановлению у спинальных больных является посттравматический глиальный рубец и обширные «пустые» пространства, которые необходимо преодолеть растущим аксонам для установления утраченных связей [3]. С другой стороны, при отсутствии консолидирующей ткани рубца между краниальным и каудальным отрезками спинного мозга [в случае обширных повреждений), они подвергаются ретракции, что делает восстановление нервных связей невозможным [4, 5]. Поэтому важной задачей реконструктивной нейромедицины является выявление способов управления скоростью и качеством образующейся ткани, замещающей нейрональный дефект.

Значительным шагом в этом направлении стало использование биополимерных материалов, в большой степени решающих эту задачу, а также создающих оптимальные условия для выживания трансплантированных клеточных культур и реализации их репаративных возможностей. В ряде экспериментов на животных было показано, что через имплантируемую биополимерную композицию, создающую своеобразный «мост» между концами рассеченного спинного мозга, возможно прорастание поврежденных аксонов и восстановление некоторых утраченных функций спинного мозга [6, 7]. При этом, мультипотентные клеточные элементы, внесенные в гелевую полимерную среду, продолжают активно функционировать, направляя вектор своей дифференцировки в соответствии с условиями локального микроокружения [8]. Это, в конечном итоге, способствует созданию благоприятных возможностей для регенерации нервных волокон, что во многом обусловлено секреторной нейротрофической деятельностью клеточных трансплантатов [8, 9].

В настоящее время вопрос о выборе оптимального клеточного материала для биоинженерной терапии таких повреждений встает особенно остро. Нерешенность ряда как биомедицинских (иммунологический конфликт, онкологическая опасность), так и этико-правовых вопросов существенно ограничивает спектр допустимых для применения клеточных линий. В свете вышесказанного, использование обкладоч-ных нейроэпителиальных клеток (ОНК) позволяет избежать проблем иммунного конфликта, а технология их получения не имеет этических, юридических и моральных ограничений. Использование только собственного донорского материала снижает (исключает) риск заражения пациента. ОНК могут быть в достаточном количестве получены из образцов ткани обонятельной выстилки носа, не формируя при этом непоправимого тканевого дефекта, поскольку их популяция находится в состоянии непрерывного самообновления [10].

В качестве основы для тканевой терапии современные исследователи предлагают использовать различные природные и синтетические материалы - коллаген, полиглюколе-вую кислоту, карбониловые нити и т. д. [11, 12]. Наилучшие результаты в этом направлении были получены в лаборатории S. Woerly (1993-1998), который предложил заполнять дефекты нервной ткани биополимерным протезом «НейроГель»™ [7], и Ch. Vacanty с соавт. (1996), которые описали результаты экспериментального использования биоматрикса [6]. В России сотрудники клиники «НейроВита» (А.С. Брюховецкий с соавт., 2002) совместно с лабораторией биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов М3 РФ (В.И. Севастьянов с соавт., 2002, 2004) разработали и запатентовали универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс «Сферогель-Э»тМ и отработали способ его получения и использования (патент РФ RU №2249462). Помимо функции «моста» Сферогель-ЭтМ способен выполнять роль «питательной среды» для содержащихся в нем клеточных элементов, индуцирующих прорастание поврежденных аксонов нервных клеток через патологически измененные участки ткани спинного мозга [11].

Целью настоящего исследования была оценка тканевых перестроек, пролиферативных процессов и характера нейрохимических изменений в тканях рубца спинного мозга у крыс, перенесших торакальную сегментэктомию с последующей трансплантацией ОНК, инкорпорированных в биопо-лимерный нейроматрикс «СферогГель-Э»тМ.

Материал и методы

В эксперименте использованы половозрелые беспородные крысы самки массой не менее 300 г. Все животные были разделены на две группы - контрольную (n=12) и опытную (n=10). Нами использована экспериментальная модель травмы спинного мозга, разработанная S. Woerly (2001) [7] и создающая ситуацию полного анатомического перерыва с утратой целостности спинномозговых оболочек. Обезболивание осуществлялось путем внутрибрюшинного введения 1 мл смеси, состоящей из 2% раствора ксилазина (0,18 мл), 10% раствора кетамина (0,36 мл) и 0,5% раствора новокаина (0,46 мл). После проведения торакальной сегментэктомии (иссечение фрагмента спинного мозга на уровне Th8-Th10) у крыс контрольной группы дефект спинного мозга заполняли гемостатической губкой и изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой. У крыс опытной группы дефект спинного мозга заполняли препаратом «Сферо-гель-Э»тМ с инкорпорированными в него ОНК. ОНК внедряли в нейроматрикс непосредственно перед трансплантацией путем последовательного наслаивания и центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин.) при температуре +10°С и вводили в количестве 250 тыс. каждому животному. Биополимерный нейроматрикс «Сферогель-Э»тМ и культура обкладочных нейроэпителиальных клеток слизистой оболочки носа человека, полученная по методике X. Zhang и совт. (2004) [13], были доставлены из лаборатории 3АО «НейроВита» (Россия, Москва).

Условия содержания животных, проведения операции и послеоперационного ухода соответствовали требованиям правил лабораторной практики в РФ (2003 г.).

Для проведения гистологического анализа изменений тканей спинного мозга в ранний (через 1-2 недели) и поздний (10-12 недель) послеоперационный период животных усыпляли путем внутрибрюшинного введения 10% раствора кетамина. Участок позвоночного столба длиной 2-2,5 см, содержащий фрагмент поврежденного спинного мозга, фиксировли в 10% нейтральном забуференном формалине. После декальцинации в растворе муравьиной кислоты образцы заключали в парафин. Гистологические препараты изготавливали по традиционной методике. Продольные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и 1% раствором метиленового синего.

Для иммуногистохимического анализа использовались моноклональные антитела к GAP-43 (Chemicon, AntiGrowth Associated Protein 43, clone 9-1E12, P17677, 1:10) и NF-200 (Chemicon, Anti-Neurofilament H&M, phosphorylated, clone NP1, P12036, 1:50). После депара-финирования и регидратации срезов их прогревали на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С 10 мМ цитратном буфере (рН 6.0) в течение 30 минут для «демаскировки» антигенов. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. и переносили в 0.1 М фосфатный буфер (рН 7.4) на 5 мин. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 мин. в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина и 1% растворе нормальной лошадиной сыворотки, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4). Инкубацию с первичными антителами проводили при 37°С в течение 1 часа, затем промывали 2 раза по 10 минут в фосфатном буфере. Иммунологическое выявление мест связывания антител проводили с помощью непрямой стрептавиадин-биотин-пероксидазной реакции с использованием стандартного набора VECTASTAIN Elite ABC Kit Universal (Vector laboratories, PK-7200) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Результаты

В зависимости от сроков послеоперационного периода все животные были разделены на две группы: 1-2 неделя (ранний период) и 10-12 неделя (поздний период). При гистологическом исследовании тканей спинного мозга животных контрольной и экспериментальных групп обнаружены значительные различия в темпах и характере морфологических изменений, сопровождающих организацию послеоперационного дефекта. Основное внимание мы сконцентрировали на состоянии тканей спинного мозга в области перерезки и пограничных участках.

Через одну неделю после операции у животных контрольной группы консолидация пересеченных фрагментов спинного мозга была еще не завершена: полость между краниальной и каудальной культями заполнена рыхлыми фибриновыми массами, которые перемежаются с очагами кровоизлияний и локальными воспалительными инфильтратами [рис. 1А-Д). В латеральных отделах рубца, примыкающих к мозговым оболочкам, отложения фибрина отграничены соединительно-тканными пластами, которые создавали на границе с веществом СМ рыхлую капсулу, в которой содержатся расширенные микрососуды и клетки воспалительных инфильтратов.

В центре рубца нити фибрина формируют подобие клубка, в то время как на границе с нервной тканью начинается образование глиальной капсулы, толщина и структура которой имеет неоднородное строение. Наиболее типичным для этого периода являются локальные скопления астроци-тов на границе рубца, расположенных, преимущественно перпендикулярно длинной оси спинного мозга [см. рис. 1В). В результате между тканью еще не оформленного рубца и смежными зонами образуется отчетливый ограничительный валик, по обе стороны которого наблюдаются единичные или сгруппированные в небольшие кластеры макрофаги и нейт-рофилы. В центральных зонах тканевого дефекта, в участках локальных гематом они превращаются в гемосидерофаги с цитоплазмой, наполненной продуктами распада эритроцитов.

В разреженном веществе спинного мозга, прилегающего к области травмы, как в краниальном, так и в каудальном направлениях, рисунок спинного мозга с резко очерченными границами серого и белого вещества практически не выявляется. Здесь обнаруживаются многочисленные пустоты, различной формы и величины. Скопления отечной жидкости вокруг капилляров, нейронов и глиальных клеток придают ткани мозга сотовидный, ячеистый вид. При малом увеличении микроскопа можно заметить, что заполненные тканевой жидкостью пространства, приобретая сливной характер, разрывают нервную ткань на многочисленные обособленные фрагменты.

Г емодинамические нарушения, максимально выраженные в пограничных зонах, реализуются как путем облитерации и запустения мелких артериол, так и за счет избыточного их расширения и гиперемии. Клетки интимы набухают и выступают в просвет сосуда, а перикапиллярные пространства расширены за счет выхода жидкой части крови через истонченные стенки сосуда. Вследствие некробиотических изменений сосудистой оболочки форменные элементы крови выходят за пределы сосуда, скапливаясь у наружной его границы или постепенно мигрируют вглубь мозговой паренхимы, приводя к образованию вторичных, диапедезных кровоизлияний.

В спинном мозге животных опытной группы в этот период обращают на себя внимание характерные изменения в области рубца. Его структура сформирована, большей частью, элементами соединительной ткани, в которой происходит образование новых капилляров (см. рис. 1Е). Соединительнотканные прослойки, окруженные фрагментами «Сферо-геля», перемежаются с участками ткани, заполненными глиальными элементами. Пролиферирующие астроциты здесь выстраиваются в тонкие, длинные цепочки, пронизывающие всю толщу рубца и ориентированные вдоль оси спинного мозга (см. рис. 1Г). Сходный глиопролиферативный процесс протекает и в промежуточной зоне, в результате чего не наблюдается формирование глиомезодермальной капсулы.

В этот период воспалительные процессы наиболее ярко протекают в промежуточной зоне и в прилегающих к ней участках рубца. Они морфологически проявляется инфильтрацией большим количеством макрофагов, сидерофагов, и некоторых лимфоидных клеток (см. рис. 1Е). Морфологические признаки изменений нейронов, глиальных клеток и элементов микроциркуляторного русла сходны с таковыми в контрольной группе и проявляются в виде набухания, вакуолизации цитоплазмы (см. рис. 1Б) или резкого сморщивания.

Через 10-12 нед. у крыс обеих экспериментальных групп соединительнотканный рубец полностью сформирован. В контрольной группе он представлен глиомезодермальной тканью с большим количеством соединительнотканных волокон, ориентированных в различных направлениях. В стенке рубца пучки соединительнотканных волокон и расположенные между ними фибробластов и глиальных клеток (очевидно, пролиферирующих астроцитов) имеют, преимущественно, перпендикулярное длиннику спинного мозга направление. Рубец у животных экспериментальной группы выглядит более рыхло. В его структуре встречаются многочисленные полости, заполненные тканевой жидкостью и окруженные прослойками соединительной ткани, с большим числом капилляров. При окрашивании метиленовым синим в соединительнотканных тяжах наблюдается большое число пучков миелинизированных нервных волокон (рис. 2).

При иммуногистохимическом исследовании на GAP-43 в тканях рубца экспериментальных животных выявляется большое количество иммунопозитивных клеток. Они имеют веретеновидную форму тела, от которого отходят длинные неветвящиеся отростки (рис. 3А). Максимальное скопление клеточных тел расположено в центральных зонах мозгового рубца (см. рис. 3 А, Б), в то время как на периферии (в области проекции белого вещества) доминирующими являются GAP-43-позитивные нервные волокна. Они имеют прямолинейный ход, четкие очертания, мало ветвятся и не образуют пучков (см. рис. 3В). У животных контрольной группы, в эти сроки выявляются только единичные GAP-43-позитив-ные клеточные элементы и тонкие волокна, преимущественно расположенные в пограничной зоне рубца краниальнее места повреждения (см. рис. 3Г).

Антителами на NF-200 у животных экспериментальной группы маркируется, исключительно нервные волокна [рис. 4). В отличие от животных контрольной группы, где наблюдаются только единичные NF-200 позитивные проводники, у крыс экспериментальной группы в толще рубца большое количество проводников содержит этот белок.

Обсуждение

Характер тканевых перестроек в спинном мозге у животных контрольной группы на 1-2 нед. полностью соответствует классическому посттравматическому стереотипу, неоднократно описанному в литературе [14], который ведет к формированию через 10-12 нед. типичного глиально-соединительнотканного рубца, ограниченного от прилежащих тканей плотной капсулой. У животных, дефект спинного мозга которых заполнялся нейроматриксом «Сферогель - Э»тМ с обкладочными клетками, к концу эксперимента рубец полностью сформирован тканью, имеющий иную цитоархитектонику. Наряду с развитой сетью астроцитов, здесь присутствуют также элементы соединительной ткани - фибробласты, пучки волокон и новообразованные микрососуды. Это свидетельствует о более раннем начале ангиогенеза и, следовательно, лучшей оксигенации рубца. Отличительной особенностью данного способа реконструкции нервной ткани является обилие нервных волокон, сопровождающих прослойки ткани в области сформированного рубца.

Предпосылки к такого рода морфологическому эффекту наблюдались уже на раннем этапе эксперимента. Так, у животных опытной группы через 1-2 нед. после операции, обращает на себя внимание иная архитектоника пролиферирующих астроцитов, которые выстраиваются в виде длинных клеточных тяжей направленных параллельно длиннику спинного мозга как внутри рубца, так и в пограничной зоне. В то же время астроцитарная реакция в контрольных образцах, протекает, преимущественно, в поперечном направлении и, очевидно, служит препятствием для развития соединительнотканных элементов и дальнейшего роста нервных волокон.

Таким образом, использование «Сферогеля-Э™» с инкорпорированной культурой ОНК позволяет сформировать более качественную протезирующую ткань между каудальным и краниальным отрезками спинного мозга, что не только позволяет избежать их ретракции, но и создает более благоприятные условия для регенерации аксонов, препятствуя образования глиальной демаркационной линии. Необходимо отметить, что похожие результаты уже получены рядом исследователей в эксперименте с использованием «Сфе-рогеля-Э™» и культуры эмбриональных нервных клеток, полученных из головного мозга крыс [15]. Использование ОНК в нашем эксперименте продиктовано огромным вниманием к ним как наилучшему клеточному материалу для трансплантации. Существуют данные, что ОНК в определенных условиях способны дифференцироваться в нейроны и глиальные элементы, что делает их весьма привлекательным объектом клеточной терапии неврологической патологии [16, 17]. С этих позиций, обнаружение по результатам им-муногистохимического анализа у животных опытной группы GAP43 - основного белка аксоногенеза и NF-200 - белка промежуточных нейрофиламентов, типичного для тканей нейронального происхождения, с достоверностью подтверждает широко обсуждаемую в литературе гипотезу о секреции обкладочными нейроэпителиальными клетками ряда нейротрофических факторов, способствующих ремиелини-зации поврежденных нервных волокон, и способности этих клеток при создании соответствующих условий дифференцироваться в нейрональном направлении [15, 16, 18].

Подняться вверх сайта