Поиск Кабинет

Молекулярный контроль плюрипотентности

Гены & Клетки: Том III, №2, 2008 год, стр.: 38-44

 

Авторы

Григорян А.С., Кругляков П.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) за счет своих уникальных свойств (самообновления популяции и плюрипотентности), обладают большим потенциалом в области регенеративной медицины. В последние годы в научной литературе появляется все больше публикаций, позволяющих представить, каким образом происходит поддержание идентичности клеток внутренней клеточной массы бластоцисты (ВКМ) в условиях in vivo, а также получаемых из ВКМ ЭСК in vitro; какие молекулярные механизмы отвечают за контроль их свойств и определяют их коммитирование и дифференцировку в специализированные типы клеток. Цель настоящего обзора - суммировать и проанализировать накопившиеся сведения о генетических и эпигенетических факторах, участвующих в поддержании свойств эмбриональных стволовых клеток млекопитающих.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из клеток внутренней клеточной массы бластоцисты (ВКМ), характеризуются двумя основными свойствами: самообновлением популяции и плюрипотентностью, то есть способностью дифференцироваться в клетки примитивной энтодермы, примитивной эктодермы и трофэктодермы, которые затем дают начало всем типам клеток внеэмбриональных и эмбриональных тканей, а также тканей взрослого организма [1]. По этой причине они обладают огромным потенциалом в сфере регенеративной медицины. Вместе с тем, трансплантации ЭСК в организм животных с экспериментально индуцированным иммунодефицитом приводят к формированию тератом - первично доброкачественных опухолей, включающих в себя производные трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы [2]. Понимание молекулярных механизмов, определяющих характеристики ЭСК, позволило бы управлять процессами поддержания плюрипотентности и запуска дифференцировки этих клеток в определенных направлениях, исключив вероятность образования опухолей.

В последние годы в научной литературе появляется все больше публикаций, позволяющих составить представление о том, каким образом происходит поддержание идентичности клеток внутренней клеточной массы бластоцисты (ВКМ) в условиях in vivo до начала коммитирования и дифференцировки, а также ЭСК в пределах популяции in vitro [3, 4]. Цель обзора - суммировать и проанализировать накопившиеся на сегодняшний день сведения о генетических и эпигенетических факторах, задействованных в поддержании свойств эмбриональных стволовых клеток млекопитающих.

Генетический контроль плюрипотентности: факторы Oct4, Nanog и Sox2

В процессе эмбрионального развития происходит постепенное изменение спектра транскрипционных факторов, действующих в различных клеточных популяциях. От этого зависит, в какой последовательности будут дифференцироваться ЭСК и какие из них сохранят плюрипотентность на более длительный период (рис. 1). Гомеодоменные транскрипционные факторы Oct4 (также называемый в литературе Oct3, либо Pou5f1) и Nanog считаются многими авторами ключевыми регуляторами плюрипотентности и экспрессируются в плюрипотентных линиях ЭСК in vitro, что было показано для клеток человека и мыши [5-7] (рис. 2). Существует гипотеза, предполагающая, что совместно с фактором FoxD3 они формируют систему регуляции транскрипции с отрицательной обратной связью, поддерживая и ограничивая экспрессию друг друга [8] (рис. 3).

Подавление экспрессии Oct4 приводит к ранней диф-ференцировке ВКМ бластоцисты in vivo и ЭСК in vitro в трофэктодерму, в то время как гиперэкспрессия этого фактора выражается в дифференцировке ЭСК в примитивные энтодерму и мезодерму. Таким образом, для поддержания плюрипотентности экспрессия Oct4 в клетках должна строго контролироваться и поддерживаться на определенном уровне [9-11]. Oct4 регулирует экспрессию тканеспецифических генов, взаимодействуя с другими факторами, а именно - c FGF-4 (fibroblast growth factor-4), специфичным для ЭСК [12], Sox2 (high mobility group box protein Sox2) [13].

Фактор Nanog был описан в 2003 году исследователями из научной группы I. Chambers. [14]. До настоящего времени считалось, что он на определенном уровне постоянно экспрессируется в клетках ВКМ и ЭСК , а его отсутствие приводит к утрате плюрипотентности и немедленной дифференцировке стволовых клеток в примитивную энтодерму [14, 15]. Однако в настоящее время показано, что его экспрессия не конститутивна и изменяется в процессе эмбриогенеза, модулируя способность ЭСК к образованию специализированных типов клеток; а при искусственном блокировании экспрессии Nanog в ЭСК не происходит немедленной активации процессов дифференцировки и клетки сохраняют плюрипотентность, полностью утрачивая, однако, способность давать начало линии первичных половых клеток [16-18].

Самая простая модель работы белков Oct4, Nanog и Sox2 предполагает, что эти факторы совместно определяют дальнейшее развитие ЭСК, взаимодействуя с другими транскрипционными факторами, ответственными за дифферен-цировку (табл.). Так, например, было продемонстрировано, что баланс Oct4 и гомеодоменного белка Cdx2 влияет на дифференцировку ЭСК в клетки трофэктодермы [19]. Oct4 и Cdx2 являются антагонистами, подавляя экспрессию друг друга. Oct4 ответственен за образование ВКМ, из которой получают ЭСК, в то время как Cdx2 необходим для развития трофэктодермы [20]. Oct4 и Cdx2 также регулируют работу белка эомезодермина (eomesodermin), который необходим для развития трофэктодермы [10]. Из этого можно заключить, что для первичной сегрегации ВКМ и трофэктодермы требуется сочетанное действие по крайней мере трех транскрипционных факторов.

Похожим образом баланс уровней фактора Nanog и продуктов целого ряда генов: Cdx2, Gata2, hCG-а и hCG-p определяет дифференцировку ЭСК в трофэктодерму [21], а соотношение концентраций Nanog, Gata4 и Gata6 регулирует дифференцировку ЭСК в энтодермальном направлении. Повышение экспрессии Gata4 и Gata6 в клетках ВКМ ведет к их дифференцировке в энтодермальном направлении, что происходит и при подавлении экспрессии Nanog, который, в частности, является негативным транскрипционным регулятором экспрессии Gata4 и Gata6 [15, 17, 21, 22-24]. Следует отметить, что Gata4 и Gata6 не являются единственными антагонистами Nanog, определяющими дифференцировку в энтодермальном направлении. Одним из менее упоминаемых генов, экспрессия которого в ЭСК человека приводит к подавлению транскрипции Nanog, является Laminin-b1 [25]. Из этого можно заключить, что некоторые факторы, функции которых считаются хорошо известными и не связанными с поддержанием свойств эмбриональных стволовых клеток, могут также участвовать в поддержании плюрипотентности и самообновления.

Oct4, Sox2 и Nanog считаются факторами, ответственными как за плюрипотентность, так и за выбор пути диф-ференцировки ЭСК. Они определяют экспрессионные паттерны транскрипционных факторов, экспрессирующихся в клетках ВКМ по прохождении эмбрионом стадии бластоцисты и в ЭСК при их коммитировании к дифференцировке. Современные данные позволяют составить довольно подробную схему контроля плюрипотентности. Картирование сайтов связывания Oct4 и Nanog в ДНК эмбриональных стволовых клеток человека и мыши [7, 25] позволило выявить ряд генов, с которыми взаимодействуют Oct4, Nanog и Sox2, а также оценить степень влияния каждого из этих факторов на процессы развития, построив, таким образом, иерархию транскрипционных факторов, действующих в ЭСК (рис. 4). Однако такая иерархия, как показывают многие работы, не универсальна, и о ней можно говорить только применительно к каждому отдельному виду живых организмов [26], что вынуждает к осторожной интерпретации данных, полученных на модельных объектах, при объяснении процессов, происходящих в ЭСК человека.

Таким образом, существует ограниченный набор ключевых транскрипционных факторов, характер экспрессии которых существенен для ранних этапов развития эмбриона и дифференцировки ЭСК в культуре. В то же время эффекты этих белков неодинаковы в условиях in vivo и in vitro, так как, по-видимому, существуют до настоящего времени неизвестные механизмы, играющие важную роль в запуске тех или иных сигнальных путей в клетках.

Эпигенетический контроль плюрипотентности

В данном случае под «эпигенетическими» рассматриваются внутриклеточные факторы реорганизации хроматина, оказывающие влияние на экспрессию генома. Реорганизация хроматина является неотъемлемой частью активации генетических программ, реализация которых определяет направление дифференцировки стволовых клеток как in vivo, так и in vitro [26-28]. Например, хроматин в ЭСК представлен в основном транскрипционно активным эухроматином, что подтверждается наличием большого количества ацети-лированных гистонов и повышенной чувствительностью хроматина к нуклеазам. В то же время коммитирование клеток сопровождается понижением степени ацетилирования гис-тонов и сопутствующим увеличением процента неактивного гетерохроматина. Таким образом, ограничение плюрипотентности тесно связано с уменьшением пластичности генома ЭСК [28].

Анализ изменений организации хроматина в ЭСК демонстрирует высокую степень динамической ассоциации структурных протеинов (основных и вариабельных гистонов, линкерного гистона H1, гистона H3, а также протеина, ассоциированного с гетерохроматином - HP1 а) с хроматином плюрипотентных ЭСК в отличие от хроматина дифференцированных клеток. Замена гистона H1 его модификацией, имеющей более высокое сродство к ДНК, приводит к ингибированию дифференцировки ЭСК; в то время как замена гистона H3 его модификацией H3.3, являющейся маркером активной транскрипции, ускоряет дифференцировку ЭСК [29]. Из этого можно сделать вывод, что структурные белки хроматина в ЭСК слабо связаны с ДНК, обеспечивая быструю реорганизацию хроматина в процессе диффе-ренцировки.

С этим согласуется тот факт, что тканеспецифичные гены в геноме ЭСК находятся в состоянии подавленной активности. Их активация при коммитировании ЭСК происходит очень быстро, так как в ЭСК постоянно присутствуют активные эпигенетические регуляторы [30, 31].

Участки ДНК в ядрах ЭСК, содержащие многие тканеспецифичные гены, образуют комплексы с так называемыми бивалентными структурными протеинами, состоящими из супрессорного гистона H3K27me3 и активирующего гис-тона H3K4me3. Это приводит к быстрому переключению транскрипционных каскадов в процессе эмбрионального развития [32, 33]. Следует отметить, что большинство генов-мишеней Oct4, Sox2 и Nanog находятся в составе таких бивалентных доменов в ДНК, что обеспечивает их быструю регуляцию (активацию и супрессию) как в процессе развития бластоцисты in vivo, так и при культивировании ЭСК in vitro [25, 33-34]. Также следует принимать во внимание участие в регуляции их экспрессии хроматин-ремодулиру-ющих транскрипционных репрессоров из семейства Polycomb-белков (PcG), которые могут индуцировать как локальные, так и глобальные перестройки структуры хроматина, тем самым влияя на экспрессию генома.

Роль PcG-факторов в поддержании свойств ЭСК

PcG-гены включают по крайней мере два различных репрессорных комплекса (PRC1 и PRC2-PRC3), строение которых крайне консервативно [37]. Роль их в поддержании плюрипотентности связана с участием в формировании паттерна экспрессии генов, отвечающих за первые этапы развития эмбриона in vivo [38-45], формирование плюри-потентных линий ЭСК в культурах in vitro [40] и поддержание недифференцированного состояния стволовых клеток взрослого организма [42, 43].

Исследования, проведенные на ЭСК человека и мыши, показали, что PRC1 и PRC2 связываются с широким спектром генов, представляющих собой транскрипционные и сигнальные факторы, роль которых в развитии известна. Гены, связанные с PcG-протеинами, в своей промоторной области также содержат гистон H3K27me3, чья супрессивная активность катализируется PRC2. Таким образом, PcG-факторы являются супрессорами транскрипционной активности тканеспецифических генов в ЭСК [33, 35]. В отсутствии одного из компонентов PRC2 - субъединицы Eed - ЭСК претерпевают спонтанную разнонаправленную дифференци-ровку [35], при этом отсутствие другого компонента - Ezn2 -никак не влияет на самообновление и сохранение плюри-потентности популяций ЭСК [40]. Это говорит о Eed как об одном из ключевых белков в регуляции поддержания плю-рипотентности ЭСК. Тем не менее, фактору PRC2 и белку Eed в литературе уделяется мало внимания.

Таким образом, сложно говорить о роли всех PcG-протеинов в поддержании плюрипотентности ЭСК. Большое число PcG-протеинов ассоциировано с генами Oct4, Sox2 и Nanog, однако не служит для подавления их экспрессии. По-видимому, Oct4, Sox2 и Nanog могут служить сигналами для активации PcG-протеинов и последующей супрессии тканеспецифичных генов [34, 35], но с уверенностью делать подобный вывод преждевременно.

Роль метилирования гистонов и ДНК в поддержании свойств ЭСК

Свидетельства влияния уровня метилирования гистонов и ДНК на экспрессию генома можно обнаружить в нескольких экспериментальных работах, где были показаны динамические изменения метилирования гистонов [46] и ДНК [47] in vivo на развивающихся эмбрионах мыши. Сразу после оплодотворения в яйцеклетке таких млекопитающих, как мышь и человек, падает уровень метилирования ДНК [48], восстанавливаясь к стадии бластоцисты в клетках ВКМ [47] и вновь постепенно снижаясь по мере развития эмбриона [49]. Профиль метилирования при этом строго видоспецифичен, и у других видов млекопитающих, таких как корова, овца и свинья, восстановления метилирования на стадии бластоцисты не происходит [50]. По-видимому, метилирование - более позднее эволюционное приобретение, чем PcG-факторы, и не является универсальным механизмом репрессии транскрипции и подавления дифференцировки клеток [51]. Наиболее распространенной разновидностью эпигенетических изменений в клетках млекопитающих является симметричное метилирование цитозина в 5' позиции в CpG динуклеотидах (в которых за цитозином располагается гуанин) [52].

Локус-специфическое метилирование гистонов и ДНК в клетках внутренней клеточной массы сохраняется в получаемых из них культурах ЭСК [50]. В случае присутствия в клетках ВКМ эпигенетических нарушений, эти нарушения сохраняются в ЭСК и их производных [53].

Эпигенетические изменения в ЭСК человека имеют большое значение с точки зрения применения этих клеток в целях регенеративной медицины. Уровень метилирования ДНК может ограничивать или, напротив, стимулировать дифференцировку ЭСК в определенные типы клеток [5456]. Например, дифференцировка ЭСК в кардиомиоциты может быть ускорена с помощью применения ингибиторов фермента ДНК-метилтрансферазы [57].

Относительно способности ЭСК приводить к формированию тератом при трансплантации в организм животных с экспериментально индуцированным иммунодефицитом также существует точка зрения, что опухоли образуются из клеток с нарушениями метилирования генома [50], поскольку многие типы онкологических заболеваний человека связаны с гиперметилированием или, наоборот, гипометилированием определенных участков ДНК [58]. С помощью метилирования могут быть подавлены гены-супрессоры опухолевого роста или, напротив, активированы протоонкогены.

Помимо значимости для медицины, характеристика изменения профиля метилирования в клетках ВКМ при развитии бластоцисты и ЭСК в процессе культивирования in vitro и дифференцировки, а также различия профилей метилирования между разными клеточными линиями ЭСК является фундаментальным вопросом биологии развития.

Заключение

Плюрипотентность популяций ЭСК определяется активностью специфических транскрипционных факторов, таких как Oct4, Nanog, Sox2 и некоторых других. Эти факторы обладают уникальными паттернами экспрессии, и от их баланса в каждый момент эмбрионального развития зависит коммитирование и дифференцировка эмбриональных стволовых клеток. В то же время, самообновление и плюри-потеность ЭСК тесно связаны со специфическими модификациями ковалентных связей гистонов с ДНК, а также степенями ассоциации транскрипционных факторов с хроматином, то есть с эпигенетическими факторами. На процессы, связанные с поддержанием свойств ЭСК, влияет активность некоторых ферментов, например хроматин-ремодулирующих факторов из PcG-группы, а также уровень метилирования гистонов и ДНК. Таким образом, невозможно выделить один или несколько ключевых факторов, от которых зависят характеристики ЭСК. Тем не менее, зная всю сложную схему взаимодействий этих факторов, можно предполагать, как отразится изменение экспрессии одного или нескольких из них на свойствах ЭСК.

Подняться вверх сайта