Том 6, № 4 (2011)

опыт зарубежных стран, в частности, сша, где совсем недавно был зарегистрирован клеточный препарат на основе стволовых клеток пуповинной крови hemacord, третью фазу клинических испы- таний проходит инновационный лекарственный препарат prochimal, в котором в качестве дей- ствующего начала используются живые клет- ки, вынуждает формулировать представления о «клеточных препаратах», а, следовательно, решать вопрос о пересмотре существующих клас- сификаций лекарственных средств, дополнений в фармакопею, выработки правил проведения доклинических и клинических исследований с этой категорией препаратов (в частности, иссле- дование фармакокинетики, фармакодинамики, а при выпуске дженериков - биоэквивалентности), создании производственных регламентов и др. по вашему мнению, может ли такой подход решить спорные вопросы о стандартизации и регламентации в создании и применении алло- генной клеточной трансплантации, например, при негематологических показаниях?

Дистрофический буллезный эпидермолиз (БЭ) явля- ется врожденным заболеванием кожи, при котором на- рушены дермо-эпидермальные связи, что при малейшем физическом воздействии приводит к отслоению эпидер- миса, заполнению образовавшейся полости жидкостью и появлению буллезных элементов. Заболевание обусловле- но мутациями в гене COL7A1, что приводит к нарушению выработки и искажению молекулярной структуры коллаге- на типа VII (С7). Характер этих мутаций и их локализация определяют различие фенотипов и тяжесть протекания бо- лезни. В настоящее время не существует методов терапии с выраженным лечебным эффектом. Разработка подходов к лечению БЭ основывается преиму- щественно на белковой, генной и клеточной терапии. На мы- шиной модели БЭ была показана перспективность белковой терапии БЭ, поскольку внутрикожные инъекции очищенного коллагена C7 человека исправляли болезненный фенотип и существенно повышали выживаемость животных. Подходы к генной терапии БЭ осуществлялись с исполь- зованием различных векторов трансдукции. Таким путем исследователям удавалось в экспериментах с помощью трансдукции кДНК либо полноразмерного гена С7 в керати- ноциты или фибробласты исправлять генетический дефект, добиваться стабильного синтеза и секреции в клетках функ- ционально активного коллагена. Существенный прогресс в решении проблемы БЭ на- метился при использовании методов клеточной терапии. Пригодными для этого оказались мультипотентные мезен- химные стромальные клетки костного мозга, поскольку способны давать начало функциональным клеткам кожи, включая кератиноциты и фибробласты. Некоторые иссле- дователи рассматривают клетки пуповины как возможный источник эпителиоцитов, способных к эпидермальной ре- конституции. Показано также, что стволовые клетки пупо- винной крови человека in vitro могут дифференцироваться в кератиноциты, то есть пуповинная кровь представляет собой хороший источник получения клеток для трансплан- тации пациентам с большими дефектами кожи. Международная группа исследователей недавно осуще- ствила начальную фазу клинических испытаний аллогенных стволовых клеток костного мозга на больных с наиболее тяжелой формой БЭ. Несмотря на скромные первые успе- хи, результаты показали, что терапия с использованием стволовых клеток в будущем может продлить и улучшить качество жизни больных БЭ.

Показана возможность стимуляции развития стволовых кроветворных клеток ксеногенными иммунными глобулина- ми, направленно действующими на CD34+ стволовые клет- ки. Эффективность подтверждена в экспериментальных исследованиях на животных с цитостатистической гемо- иммунодепрессией и при культивировании in vitro CD34+ стволовых кроветворных клеток человека. Животные, получавшие специфические иммунные глобулины восста- навливали гемопоэз и иммунитет к 30 сут. наблюдения, в контрольной группе регенерация гемолимфопоэза проис- ходила по истечении 60 сут. In vitro более, чем на 30% увеличивалась колониеобразующая способность стволо- вых кроветворных клеток при добавлении в среду антител к CD34+ стволовым клеткам. Наши предварительные дан- ные свидетельствуют о способности ксеногенных антител к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам стимулировать их дифференцировку в остеобласты и эн- дотелиоциты - ключевые клеточные элементы, формирую- щие нишу стволовых кроветворных клеток.

Изучен пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) в зависи- мости от способа криоконсервирования. Определена дли- на теломер и колониеобразующая способность (КОС) ГСК ПК. Длина теломер измерена с использованием новейшего метода, сочетающего проточную цитометрию и флуорес- центную гибридизацию in situ (FISH). Исследования вы- полнялись на проточном цитофлуориметре Cytomics FS- 500 (Beckman Coulter, Швейцария). Для флуоресцентной гибридизации in situ использовался PNA-зонд, меченный FITC (DAKO, Дания). КОС ГСК ПК исследовалась в полной культуральной среде на основе метилцеллюлозы Н4435 MethoCult® (StemCellTechnologies, Канада). Криоконсер- вирование образцов проводилось в программном замо- раживателе Planer и парах жидкого азота. Установлена корреляция между длиной теломер ГСК ПК и их КОС. При сравнении сохранности пролиферативных свойств ГСК ПК при криоконсервировании в программном замораживателе и парах жидкого азота доказано преимущество применения программного замораживателя для сохранения ГСК ПК. Таким образом, для криоконсервирования образцов ГСК ПК целесообразно использовать программный заморажи- ватель, так как при данном способе сохранения образцов клетки остаются жизнеспособными и функционально пол- ноценными. Длина теломер может служить важным марке- ром сохранности пролиферативного потенциала ГСК ПК.

В работе сконструировано и охарактеризовано се- мейство опорных клеточных носителей в виде мембран, полученных из резорбируемых полигидроксиалканоатов (ПГА) - полимеров микробиологического происхожде- ния различного состава. Исследованы 5 типов ПГА: го- мополимер 3-гидроксимасляной кислоты, сополиме- ры 3-гидроксимасляной и 4-гидроксимасляной кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот. С использованием растровой электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии изучена микроструктура по- верхности мембран и показано, что наиболее шерохова- той поверхностью обладали мембраны из сополимеров с 3-гидроксигексаноатом, наиболее гладкой - из сополиме- ров 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом. Показано снижение краевых углов смачивания водой и возрастание гидрофильности у клеточных носителей из сополимеров по сравнению с носителями из высококристалличного го- мополимера 3-гидроксимасляной кислоты. На примере культуры фибробластов мыши линии NIH 3T3 по резуль- татам окрашивания культивируемых клеток флуоресцент- ным зондом на ДНК DAPI и в МТТ-тесте выявлено, что все представленные типы ПГА не проявляют цитотоксичности при прямом контакте с клетками, обладают высокой био- совместимостью; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию фибробластов сопоставимы с полистиролом и превосходят полимолочную кислоту.

Широкое распространение хронических гепатитов и не- достаточная эффективность их лечения требуют разработки новых подходов к терапии данной патологии. Одно из пер- спективных направлений поиска связано с использованием для стимуляции дифференцировки мультипотентных мезен- химальных стромальных клеток (ММСК) в гепатоциты фак- тора роста фибробластов 4 и фактора роста гепатоцитов, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Известно, что естественным источником данных факторов в печени являются звёздчатые клетки печени (ЗКП), выполняющие роль микроокружения, необходимого для дифференцировки эпителиальных клеток печени в онтогенезе и при регенерации органа. Целью насто- ящего исследования стало изучение возможности стимуля- ции гепатоцитарной дифференцировки ММСК костного мозга крысы путём культивирования в среде, кондиционированной звёздчатыми клетками печени. ММСК культивировали в раз- личных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов сре- де; 2) в среде с последовательным добавлением факторов роста; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупрони- цаемой мембраной; 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП. Результаты исследования показали, что вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины ока- зывают выраженное воздействие на ММСК, индуцируя их дифференцировку в гепатобласты и гепатоциты, стойко (в отличие от ММСК, культивированных с факторами роста) сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и альфа- фетопротеина. Непосредственные межклеточные контакты ММСК и ЗКП в ко-культуре стимулируют более массовую и выраженную экспрессию гепатоцитарных маркёров в культи- вируемых клетках по сравнению с монокультурой, однако при этом феномена слияния клеток двух популяций не выявле- но. Таким образом, результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, обеспечивающего реализацию потенций ММСК к дифференцировке по гепатоцитарному пути в усло- виях in vitro.

Регенерация костной ткани нижней челюсти у крыс при использовании нового остеопластического материала «ТИОПРОСТ» по сравнению с материалом «КоллапАн-М» изучена методами световой микроскопии. Полученные ре- зультаты показали, что скорость восполнения объема кост- ного дефекта при использовании «ТИОПРОСТа» более чем на 1 мес. опережает регенерацию костной ткани при ис- пользовании материала «КоллапАн-М». Установлено, что после заполнения дефекта костной ткани «ТИОПРОСТом» он образует пористую трехмерную конструкцию, которая выполняет поддерживающую функцию, являясь тканеин- женерной матрицей, не обладает провоспалительными свойствами и. «ТИОПРОСТ» ограничивает продолжитель- ность стадий альтерации и экссудации воспаления в ране. В процессе биодеградации «ТИОПРОСТ» индуцирует актив- ный рост кровеносных сосудов из ложа костного дефекта в каналы тканеинженерной матрицы. Полученные данные развивают существующие представления о роли свободно- радикальных процессов в механизмах посттравматической регенерации костной ткани и обосновывают целесообраз- ность использования антиоксидантных соединений для оптимизации остеогенеза при повреждении костной ткани.

Применение клеточных технологий с целью восста- новления нервной ткани и, в частности, для восполнения повреждений спинного мозга (ПСМ), находит все более широкое применение в мире. Однако пока еще не реше- ны проблемы безопасности применения клеточных препа- ратов, не изучены побочные эффекты этой терапии. Це- лью исследования стала оценка безопасности, выявление осложнений и особенностей клинического применения мобилизованных аутогенных гемопоэтических стволовых клеток (АГСК) в комплексной терапии пациентов с ПСМ. Изучали осложнения на всех этапах лечения ПСМ: на этапе мобилизации АГСК в периферический кровоток, на этапе сепарации и клеточной терапии. В ходе работы было уста- новлено, что общая частота осложнений достигала 75%. Проведенное исследование показало, что терапия препара- тами АГСК пациентов с ПСМ требует специализированной подготовки персонала и должна проводиться только в усло- виях отделения реанимации многопрофильного стационара под контролем гематолога, реаниматолога и невролога, имеющих опыт применения высокотехнологичных методов лечения.