Hydrogel of biocompatible carbomers as matrix for elimination of neural tissue defects

Full Text

Для эффективной посттравматической нейрорегенерации представляется актуальной реконструкция тканевого матрикса в потенциальном пространстве роста аксонов [1]. Этот подход активно разрабатывается как для ЦНС [2, 3], так и для периферического нерва [4]. Для подобных задач наиболее исследованы природные биоматериалы, такие как коллаген [5], фибрин [6, 7], фибронектин [8]. В последнее время особое внимание уделяется гидрогелевым матриксам на основе синтетических биосовместимых и биодеградируемых материалов, таких как полиэфиры полилактид-когликолид [9], полиметакрилаты [10, 11] и др. Поиск синтетических биоматериалов для поддержания процесса нейрорегенерации активно продолжается. К подобным материалам стали предъявлять дополнительные требования. Для более эффективной нейропротекции и стимулирования регенерации нервных волокон имплантируемый биоматрикс на основе синтетических биоматериалов должен сочетаться с нейротрофическими факторами [12, 13], фармакологическими нейропротекторами и стимуляторами нейрорегенерации [14, 15].

В работе проведена оценка эффективности посттравматической регенерации нервных волокон в периферическом нерве и спинном мозге в условиях имплантации в разрыв нервной ткани гидрогеля на основе биосовместимых карбомеров - полиакриловой кислоты [ПАК] и Carbopol® 971Р NF.

ПАК образует высоковязкие, кристаллические гидрогели [16], которые хорошо сочетаются с лекарственными, физиологически активными веществами и ферментами [17]. Карбомеры Carbopol являются полимерами акриловой кислоты, сшитой с алильными эфирами пентаэритритола или дивинил-гликоля, образуют гелевую матрицу, обеспечивающую пролонгацию действия активных фармацевтических субстанций [18], и превосходят часто используемый для этой цели полимер — натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы [КМЦ] [18].

В работе проведено сравнение эффективности регенерации нервных волокон при использовании этих биоматериалов и КМЦ, положительно зарекомендовавшей себя как поддерживающая среда для фармакологических нейропротекторов и стимуляторов регенерации периферического нерва [19, 20].

В эксперименте и клинике на сегодняшний день остается практически нереализованным подход с локальным применением фармакологических нейропротекторов и стимуляторов роста нервных волокон, подводимых к месту повреждения нервной ткани. Между тем, наши предыдущие исследования с прицельной доставкой к шванновским клеткам, расположенным в области травмы нервных проводников, фармакологического стимулятора регенерации нерва ксимедона указывают на перспективность подобного подхода [19]. В качестве отдельной задачи в работе исследовано влияние композиции аминокислот и микроэлементов [М4], введенной в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol. Композиция М4 включает десять природных аминокислот [валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, метионин, лизин, серин, гистидин и глутаминовая кислота] и ряд микроэлементов [медь [II], марганец [II], кобальт [II], кальций [II], литий [I]], является малотоксичной и запатентована на предмет возможного применения в медицине [21]. Широкий спектр биологического действия композиций аминокислот и олигопептидов с микроэлементами [21, 22] даёт основание полагать, что их системное воздействие на организм осуществляется через ЦНС в тесной взаимосвязи с иммунной системой. Эта проблема интенсивно разрабатывается в отношении нейропептидов [23], но не аминокислот самих по себе.

Материал и методы

Эксперименты на седалищном нерве проведены на белых беспородных крысах-самцах весом 150-200 г [n = 32]. Для опытов со спинным мозгом использовали белых беспородных мышей-самок весом 30-50 г [n = 27]. Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18- 20°С со свободным доступом к воде и пище.

Тубуляция седалищного нерва крысы. У животных под уретановым наркозом [600 мг/кг, внутрибрюшинно] в левом седалищном нерве на уровне середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм. Центральный и периферический концы нерва соединяли силиконовой трубкой [НІ/ІІ/ІРП, Россия] длиной 7 мм и внутренним диаметром 2,2 мм. Трубку фиксировали при помощи четырех эпиневральных швов мононитью 8.0 с атравматической иглой [Целита, Россия]. Непосредственно перед фиксацией в трубку вводили гелевый матрикс на основе натриевой соли 1,8% Carbopol® 971Р NF [Noveon], натриевой соли 2% ПАК [Aldrich, м.в. 3000000] или 8% натриевой соли КМЦ [Pierre Fabre], Значения pH для гидрогелей Carbopol и ПАК поддерживали в пределах pH 6.3-7.3 путём добавления к растворам набухших полимеров гидроксида натрия [Sigma], контроль pH осуществляли на pH-метре Thermo Orion 420А+. У животных опытных групп в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol вводили композицию аминокислот и микроэлементов М4 с общим содержанием аминокислот 9%.

Первым контролем служили животные с введением в трубку только ПАК или Carbopol без композиции М4. Во второй контрольной группе животные были прооперированы в тех же условиях, но тубуляцию нерва проводили при помощи пустой трубки.

□ восстановлении функции двигательных нервных волокон судили по функциональному индексу седалищного нерва [24]. Восстановление функции афферентных нервных волокон определяли, тестируя чувствительность кожи конечности [25]. Функциональные тесты во всех группах проводили на2,7,11,14,18,21,25и 28-е сут. после операции. Достоверность различий оценивали по Стьюденту.

Через 30 суток после операции под уретановым наркозом [600 мг/кг] после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии L5 на стороне операции, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заключали в парафин по стандартной методике. Одновременно забирали 5 мм фрагмент периферического отрезка нерва дистальнее места травмы, фиксировали в 2,5% глутаральдегиде и 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон-аралдит. Полутонкие срезы, окрашенные метиленовым синим, использовали для подсчета количества миелиновых волокон. На парафиновых срезах спинального ганглия толщиной 7 мкм подсчитывали количество выживающих нейронов [26]. Оценивали количество малых [< 30 мкм²], средних [30-50 мкм²] и больших [> 50 мкм²] нейронов с видимыми ядрышками [26, 27].

У мышей под уретановым наркозом [600 мг/кг, внутрибрюшинно] после ламинэктомии производили полную перерезку спинного мозга на уровне T9. Животным опытной группы в разрыв спинного мозга вводили гель на основе ПАК или Carbopol в количестве 0,0036-0,0040 г, содержащий композицию М4. Контролем служили животные без введения в разрыв спинного мозга гидрогелевого матрикса, а также мыши, которым в гидрогелевый матрикс не вводили композицию М4. В течение пяти дней после операции животные получали 1% раствор цефазолина [6 мг/кг] для предотвращения послеоперационных осложнений. Ежедневно принудительно опорожняли мочевой пузырь. Восстановление локомоторной функции оценивали при помощи теста в открытом поле [28] на2,7,11,14,18,21,25 и 28-е сут. после операции. Статистическую обработку результатов проводили методом ANCVA, а также с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Во всех экспериментальных группах с тубуляцией функциональный индекс седалищного нерва возрастает к 7-м сут. после операции. В группе животных с введением в трубку гидрогелевого матрикса на основе ПАК этот показатель, по сравнению с животными из группы с пустой трубкой увеличивается на 21,25 и 28-и сут. после операции соответственно на 25,1%, 20,4% и 20,9% [Р < 0,05]. На 21 сут. после операции функциональный индекс седалищного нерва в группе животных с ПАК на 27,2% больше [Р < 0,05], чем у животных с КМЦ. Carbopol и КМЦ не влияли на восстановление двигательной функции нерва.

Различия по показателю восстановления чувствительности кожи конечности в сравнении с контролем [группа с пустой трубкой] зарегистрированы только в случае с ПАК. При этом данный показатель на сроках 11,14,18 и 28 сут. возрастает соответственно на 17,3%, 18,7%, 11,2% и 13% [Р < 0,05]. В экспериментальной группе с ПАК на 21, 25 и 28-е сутки после операции зарегистрировано увеличение показателя восстановления чувствительной функции нерва соответственно на 30,1%, 40,1%, 40,2% [Р<0,05], по сравнению с одноименным показателями у животных в группе с Carbopol.

 

Рис. 1. Функциональный индекс седалищного нерва после его перерезки и формирования кондуита с гидрогелевым матриксом.

По оси ординат — значения функционального индекса:

* — Р <0,05 при сравнении показателей опытных групп и группы животных с пустой трубкой [контроль];

х — Р<0,05 при сравнении ПАК и КМЦ

 

Рис. 2. Динамика восстановления чувствительной функции кожи после перерезки седалищного нерва и формирования кондуита с гидрогелевым матриксом.

По оси ординат — значения чувствительной функции в относительных единицах:

* — Р < 0,05 при сравнении показателей опытных групп и группы животных с пустой трубкой [контроль];

х — Р < 0,05 при сравнении ПАК и Carbopol

 

Анализ функциональных тестов свидетельствует, во-первых, о том, что включение в состав кондуита нерва гидрогелевого матрикса оказывает стимулирующее влияние на рост нервных волокон. Во-вторых, из протестированных биосовместимых материалов по критериям восстановления двигательной и чувствительной функции более эффективным оказался матрикс на основе ПАК.

Гелевый матрикс на основе Carbopol и ПАК [в большей степени] оказывает нейропротекторное действие в отношении чувствительных нейронов. Посттравматическое выживание этих нейронов в спинальном ганглии L5, по сравнению с контролем [пустая трубка], увеличивается на 12,3% [Р < 0,05], в случае введения в трубку Carbopol, а при введении ПАК— на 20,2% [Р < 0,05], различий в сравнении с КМЦ зарегистрировано не было.

Количество выживающих после травмы нерва больших нейронов в группе с ПАК по сравнению с группой животных с пластикой нерва при помощи пустой трубки, увеличивается на 9,4% [Р<0,05]. Различия в количестве больших нейронов при формировании кондуита нерва с Carbopol или КМЦ не выявлены. Количество средних нейронов при введении в трубку геля на основе Carbopol и ПАК превышает данный показатель у животных с пластикой нерва пустой трубкой соответственно на 22,2% [Р < 0,05] и 29,7% [Р < 0,05]. Различия при сравнении групп с КМЦ не зарегистрированы. Количество средних нейронов в группе ПАК на 10,8% [Р < 0,05] превышает количество этих нейронов у животных с содержанием в трубке Carbopol. Различия в количестве малых нейронов не зарегистрированы.

Количество миелиновых волокон к 30 суткам, в группах [ПАК, Carbopol и КМЦ] не отличается от контроля [пустая трубка]. При этом количество регенерирующих миелиновых волокон в группе с ПАК на 10,3% [Р < 0,05] превышает их количество в группе с Carbopol.

 

Рис. 3. Распределение нейронов по популяциям в спинальном ганглии L5 к 30 суткам после перерезки седалищного нерва и формирования кондуита с гидрогелевым матриксом.

Черные области — большие нейроны, серые — средние нейроны, белые — малые нейроны. По оси ординат — относительное количество нейронов: * — Р < 0,05 при сравнении показателей с группой животных с пустой трубкой

 

Рис. 4. Количество миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва на 30 сутки после тубуляции нерва с гидрогелевым матриксом.

По оси ординат — количество миелиновых волокон:

* — Р < 0,05 при сравнении ПАК и Carbopol;

** — Р < 0,05 при сравнении ПАК+М4 и Carbopol+M4

 

Введение композиции М4 в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol не изменяет показатель двигательной функции седалищного нерва, однако при этом улучшается показатель восстановления чувствительности кожи конечности в случае использования Carbopol. На 21, 25 и 28-е сут. после тубуляции седалищного нерва данный показатель в группе с Carbopol+M4 увеличивается соответственно на 21,7%, 15,6% и 14,9% [Р < 0,05], по сравнению с контролем [матрикс на основе Carbopol без композиции].

Введение композиции М4 в гидрогелевый матрикс на основе ПАК не оказывает положительного влияния на восстановление чувствительности. Практически на всех сроках тестирования ПАК без добавления композиции М4 в большей мере поддерживает восстановление чувствительности нерва, чем ПАК+М4 [в среднем на 36,6%, Р < 0,05].

После травмы нерва количество выживающих больших нейронов в группе Carbopol+M4 увеличивается на 13,8% [Р < 0,05], по сравнению с контролем [Carbopol], и на 14,2% [Р < 0,05] в группе с ПАК+М4, по сравнению с контролем [ПАК]. По критерию посттравматического выживания этих нейронов ПАК на 14,9% [Р < 0,05] более эффективен, чем Carbopol. Композиция М4, введенная в состав гидрогелей, не оказывает влияния на количество средних нейронов. Количество малых нейронов в группе с ПАК на 15,8%[Р<0,05] больше по сравнению с ПАК+М4.

Подсчет миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва крысы показывает более эффективное влияние композиции в случае применения ПАК. Так, в группе ПАК+М4 данный показатель на 8,6% [Р < 0,05] больше, чем в группе Carbopol+M4.

 

Рис. 5. Динамика восстановления локомоторной функции при тестировании в открытом поле после перерезки спинного мозга мыши и введения в разрыв гидрогелевого матрикса.

По оси ординат — показатель теста:

* — Р < 0,05 при сравнении Carbopol+M4 с Carbopol, а так же с контролем (перерезка спинного мозга без введения гидрогелевого матрикса в разрыв)

 

У мышей после полной перерезки спинного мозга на уровне T9 восстановление локомоторной функции начинается к концу первой недели в виде незначительных движений конечностей и к 30-м сут. характеризуется подвижностью в голеностопном и коленном суставах. Наибольшие значения показателя локомоторной активности зарегистрированы при введении в разрыв спинного мозга Carbopol с композицией М4 и на 7, 11 и 14-е сут. после операции данный показатель выше соответственно на 52,6%, 46,6% и 50,9% [Р < 0,05], по сравнению с животными контрольной группы [перерезка спинного мозга без введения гидрогеля в разрыв]. В группе животных с введением в разрыв Carbopol+M4 на тех же сроках выявлено увеличение показателя локомоторной активности соответственно на 47,2%, 55,6% и 47,1% [Р < 0,05] по сравнению с животными контрольной группы с введением в разрыв только Carbopol.

Из всех протестированных в настоящей работе биосовместимых материалов ПАК проявила себя как наиболее эффективная среда для поддержания посттравматической регенерации периферического нерва. Под влиянием ПАК показано более динамичное восстановление двигательной и чувствительной функции нерва. Последний показатель коррелирует с наиболее выраженным позитивным влиянием ПАК на посттравматическое выживание чувствительных нейронов. Однако, введение композиции в состав данного гидрогеля, по-видимому изменяет его структуру и не позволяет волокнам регенерировать. С другой стороны, композиции несут противоположный эффект при использовании с Carbopol, что хорошо прослеживается при травме спинного мозга на ранних сроках тестирования. Отсутствие сдвигов в количестве миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва на фоне положительной динамики показателей функциональных тестов и количества выживающих чувствительных нейронов можно объяснить тем, что к 30-м сут. после травмы нерва и формирования его кондуита из центрального в периферический отрезок прорастают преимущественно безмиелиновые волокна.

Достаточно велика вероятность того, что аминокислоты из применённой нами композиции способны участвовать в сборке олигопептидов, которые служат молекулярными «строительными лесами» в составе гидрогелевого матрикса и формируют направляющие пути в пределах тканевых дефектов. Подобные самособирающие системы из олигопептидов могут не только формировать тканевый матрикс, но и позитивно влиять на внутриклеточные сигнальные пути, поддерживая выживание нейронов и рост аксонов в центральной и периферической нервной системе. Это предположение согласуется с данными, представленными в работе Ellis-Behnke et al. [29], в которой даны обнадёживающие результаты по регенерации аксонов ЦНС и восстановлению функции при формировании в области разрыва зрительного тракта специального матрикса из самособирающихся нановолокон, состоящих из олигопептида с последовательностью аргинин - аланин - аспартат - аланин.

При поддержке гранта РФФИ №07-04-00746-а.

About the authors

G. A. Fomina

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

R. F. Masgutov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

V. G. Shtyrlin

Butlerov Chemistry Institute of Kazan State University, Coordination Compounds Laboratory

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

Yu. l. Zyavkina

Butlerov Chemistry Institute of Kazan State University, Coordination Compounds Laboratory

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

Yu. A. Chelyshev

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files