Vol 5, No 4 (2010)

27 сентября в Москве состоялся III Международный симпозиум «Актуальные вопросы клеточных технологий». Организаторы пригласили для участия в нем известного ученого, руководителя лаборатории Division of Reproductive Sciences (Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University) Шухрата Миталипова, который после своего доклада любезно согласился ответить на вопросы редакции.

В статье представлен обзор о способах трансфекции МСК и их эффективности. Проведен анализ экспрессии трансфицированных генов при стабильной и транзиторной трансфекции. Указаны возможные причины снижения экспрессия трансгенов и пути ее повышения.

В работе представлены данные о способности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток образовывать популяции хондрогенных и остеогенных тканей в пористо-проницаемых инкубаторах из никелида титана. Установлено достоверное увеличение активности щелочной фосфатазы и процентного веса сухого инкубатора в остеогенной среде, а также значительное повышение содержания ДНК в инкубаторе в хондрогенной среде. Сканирующая электронная микроскопия показывает развитие клеток в поровом пространстве инкубатора во временном интервале. Комплексное исследование на патофизиологической модели опухолевого роста показало эффективное антиметастатическое действие общей популяции клеток аллогенного костного мозга в инкубаторах из пористого никелида титана и их пролонгированный эффект.

Цель работы - оценка in vitro острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности образцов натурального коралла (НК) семейства Асrороrа, in vivo - их биосовместимости и остеозамещающих потенций. Исследование острой цитотоксичности (24 ч культивирования) и матриксных свойств поверхности частиц НК (1-14 сут. культивирования) было выполнено на культуре иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ), жизнеспособность которых оценивали с помощью MTT-теста. Биосовместимость НК изучали на модели подкожной имплантации крысам его частиц. Остеозамещающие потенции НК оценивали на моделях ограниченного (краевая резекция большеберцовой кости крыс) и критического (сегментарная резекция бедренной кости барана) костных дефектов. Оперативные вмешательства на животных производили под общим обезболиванием. В экспериментах in vitro с помощью MTT-теста было показано, что НК нетоксичны в отношении культуры ФЧ и обладают выраженными матриксными свойствами. При подкожной имплантации происходила биорезорбция частиц НК без признаков отторжения и воспалительной реакции вокруг них. У крыс замещение костного дефекта частицами НК обеспечивало полное закрытие дефекта через 9 нед. При этом остеогенез в зоне дефекта происходил в непосредственной топической связи с частицами имплантированного НК. У барана при использовании цельного НК-имплантата через 6 мес. после операции на микропрепаратах наблюдалось почти полное замещение вещества НК компактной костной тканью с формированием органотипических структур (остеонов). Полученные результаты свидетельствуют о том, что скелет НК сем. Асrороrа обеспечивает эффективную адгезию и длительную пролиферацию ФЧ, биосовместим и обладает выраженными остеорепаративными свойствами, способствует формированию в зоне дефекта зрелой костной ткани путем периостального остеогенеза.

Трансплантацию генетически модифицированных клеток (стволовых, предшественниц, дифференцированных) активно исследуют как способ доставки ростовых факторов и молекул адгезии в поврежденную нервную ткань для поддержания жизнеспособности нейронов, обеспечения регенерации нервных отростков и восстановления утраченных межклеточных контактов. В настоящем исследовании для лечения бокового амиотрофического склероза на модели трансгенных мышей G93A мы сконструировали плазмидный вектор pBud-VEGF-L1САМ, одновременно экспрессирующий молекулы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и нейронной молекулы адгезии L1 (L1CAM). Для доставки вектора в спинной мозг мышей использовали мононуклеарные клетки пуповинной крови человека. Трансплантация генетически модифицированных клеток, трансфицированных плазмидными векторами pBud-VEGF-L1САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L1САМ, выполнена путём инъекции (1x106 клеток) в ретроорбитальное пространство мышей. Через две недели после трансплантации для идентификации и фенотипирования генетически модифицированных мононуклеарных клеток проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью антител к ядерному антигену человека (HNA) и одному из клеточных маркёров (эндотелиоцитов - CD34, астроцитов - S100, олигодендроцитов - OSP, микроглии - Iba1). При исследовании гистологических срезов спинного мозга мы обнаружили HNA+CD34+-клетки как в белом, так и в сером веществе во всех экспериментальных группах. Маркёры макро- и микроглии в HNA+ -клетках не выявлены. Таким образом, сверхэкспрессия генов VEGF и/или L1CAM в монононуклеарных клетках пуповинной крови человека не влияет на их способность дифференцироваться в эндотелиоциты в спинном мозге трансгенных мышей G93A. Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови геном молекулы адгезии L1cam подтверждена повышенной жизнеспособностью трансплантированных клеток, а геном сосудистого эндотелиального фактора роста vegf - поддержанием дифференцировки эндотелиоцитов и нейропротекторным действием на повреждённые нейроны.

Проведена оценка in vitro клеточных и молекулярных процессов в многоклеточной системе мононуклеарных клеток крови 4 здоровых добровольцев при кратковременном (52 ч) контакте с искусственными материалами, in vivo индуцирующими остеогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. В качестве раздражителей использованы титановые диски (диаметр 10 мм) с композитным (полимерно-кальцийфосфатным) и кальцийфосфатным покрытиями в остеогенной культуральной среде. Установлено с помощью цитологических, цитохимических методов и иммуноферментного анализа, что во фракции мононуклеарных лейкоцитов крови здорового человека может циркулировать до 18-29% стромальных, в том числе клоногенных клеток, индуцируемых in vitro к фибробластоподобной трансформации искусственным материалом с полимерно-кальцийфосфатной поверхностью. TNFα является одним из факторов, способствующих фибробластоидной морфофункциональной активности мононуклеарных клеток крови при сокультивировании с полимерно-кальцийфосфатным материалом. Разработанная методология может оказаться полезной в приложении к задачам клеточной терапии и тканевой инженерии.

Представлены отдаленные результаты лечения последствий спинальной травмы с использованием трансплантации фетальных клеток головного мозга и печени. В клиническое исследование было включено 43 пациента (11 мужчин, 32 женщины в возрасте от 17 до 55 лет). Давность травмы к моменту начала лечения варьировала в пределах от 9 мес. до 6 лет. Клетки трансплантировали либо интраоперационно в виде плазматического сгустка, либо субарахноидально в виде суспензии посредством люмбальной пункции. Согласно шкале FIM (Functional Independence Measure), ощутимые неврологические улучшения были отмечены у 21 пациента (49%): у 13 (30 %) на 1-10 и у 8 (19%) на 10-50% баллов. Улучшение функции тазовых органов, улучшение чувствительности и уменьшение спастики отметили 18 (42%), 10 (27%) и 5 (14%) пациентов, соответственно. Из 20 пациентов с давностью травмы к моменту начала лечения до 2 лет значимые улучшения были отмечены у 14 (70%) человек. Из 23 пациентов с давностью травмы, превышающей 2 года, улучшения были достигнуты только у 7 (30%) человек. Таким образом, клеточные технологии могут быть эффективно использованы в лечении значительной части спинальных пациентов, лечение которых с позиций общепринятой медицины представляется малоэффективным.