Vol 4, No 1 (2009)

24 декабря 2QQ8 г. в Российской академии медицинских наук состоялось заседание президиума РАМН, посвященное возможностям применения стволовых клеток пуповинной крови в лечении ряда заболеваний нервной системы. Членам президиума РАМН и многочисленным слушателям были представлены результаты лечения болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, шизофрении, детского церебрального паралича, посттравматической энцефалопатии. Данные клинические испытания были анонсированы 28 марта 2008 г. на факультете психологии МГУ академиком РАМН В.Н. Смирновым и стартовали в апреле 2008 года.

Соматические стволовые клетки (СК) - резиденты тканей взрослого организма - находятся в постоянном контакте со специфическим микроокружением, так называемой тканевой нишей [stem-cell niche], транслирующей внешние сигналы и регулирующей самообновление и дифференцировку СК. Ниша стволовых клеток представляет собой вполне определенную анатомо-физио-логическую единицу, включающую как сами СК, так и взаимодействующие с ними клетки, компоненты внеклеточного матрикса и источники нейрогуморальных регуляторных сигналов: сосудистую сеть и нервные окончания [1]. Однако трехмерная реконструкция этой многокомпонентной системы по данным микроскопии стандартных гистологических препаратов затруднена, поскольку многие важные структурные элементы теряются в срезах тканей. Данная проблема особо актуальна в случае воссоздания микроархитектоники ниши для нейральных стволовых клеток СНСК), где многочисленные отростки нейронов и глиальных клеток, разветвленные капилляры и молекулы внеклеточного матрикса создают чрезвычайно сложную сеть.

В исследованиях последних лет было обнаружено, что в составе общей массы трансформированных клеток при остром миелоидном лейкозе СОМЛ) у человека существует малочисленная популяция лейкозных стволовых клеток ШСК). Серийная трансплантация именно этой популяции клеток приводит к возникновению ОМЛ у иммунодефицитных мышей-реципиентов, тогда как туморогенный потенциал других популяций опухолевых клеток ограничен [1]. ЛСК имеют фенотипическое и функциональное сходство со стволовыми кроветворными клетками (СКК) и, как было показано, обладают большой резистентностью к применяемой для лечения ОМЛ химиотерапии и, вероятно, являются источником рецидивов [2]. В связи с этим, ЛСК привлекли особое внимание ученых и клиницистов, так как разработка методов терапии, направленных на их уничтожение, может привести к революции в лечении ОМЛ, а также целого ряда других гематологических и солидных злокачественных новообразований. Тщательное изучение биологии ЛСК сталкивается со значительными трудностями, что прежде всего обусловлено малочисленностью этой популяции клеток. Изоляция ЛСК стала возможна только при использовании высокоэффективной сортировки «клеток-кандидатов» на основании паттерна экспрессируемых на поверхности антигенов методом FACS [3]. В качестве реципиентов при последующих трансплантациях, как правило, используются мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом CNOD/SCID), которые характеризуются рядом выраженных дефектов в Т-, В-, NK-клетках и системе комплемента, что позволяет использовать их в качестве универсальных «биореакторов» [4]. Именно при использовании этой линии мышей было показано, что ЛСК при ОМЛ имеют иммунофенотип CD34+CD38-, тогда как CD34+CD38+ клетки характеризуются низкой туморогенной активностью [3].

Функциональное состояние гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регулируется совокупностью внешних сигналов от специфического микроокружения, называемого «нишей» стволовых клеток [1]. Полагают, что терапевтические манипуляции на уровне ниши ГСК могли бы стать весомой альтернативой трансплантационным подходам в клинике. Однако до сих пор нет единого мнения о том, какова молекулярная природа регулятор-ных сигналов в нише и какие клетки отвечают за их продукцию. В последние годы был обнаружен ряд молекул [ангиопоэтин, тромбопоэтин, хемокин CXCL12, остео-понтин и др.], нарушение экспрессии которых существенно сказывается на взаимодействии ГСК со своей микросредой. Иммуногистохимические исследования, в свою очередь, показали, что ГСК локализуются вблизи эндоста - гетерогенного слоя клеток, выстилающего костномозговую полость [так наз. «эндостальная» ниша ГСК]. Эндостальная выстилка образована остеобластами, остеогенными клетками-предшественниками [часто обозначаемыми как «клетки костной выстилки» - bone-lining cells] и остеокластами; при этом остеобласты рассматриваются как главный клеточный компонент эндоста, отвечающий за регуляцию ГСК [2, 3].

В результате эмбрионального миогистогенеза из стволовых клеток миотома сегментированной мезодермы путем дивергентной дифференцировки развиваются два взаимодействующих между собой дифферона: камбиальный и симпластический, которые формируются параллельно и определяют в постнатальном периоде репаративные свойства [1, 2]. Первый дифферон представлен миосателлитоцитами, впервые описанными A. Maura (1961], развивающимися из промиоцитов, локализуется между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон и является морфофункциональ-ной основой камбиального резерва тканевой системы скелетной мышцы. В постнатальном периоде активная пролиферация миосателлитоцитов определяется уже к третьему дню после повреждения ткани. После серии митозов в посттравматическом рабдомиогенезе из них формируется популяция миобластов, которые, сливаясь, образуют новые мышечные симпласты [1-3]. Симпластический дифферон также участвует в репаративной регенерации: вблизи линии разрыва волокна делятся, ядра, симпласты колбообразно утолщаются с формированием «мышечных почек», растущих по направлению друг к другу с тенденцией к слиянию [4]. Однако вопрос о механизмах репаративной регенерации мышечных симпластов до настоящего времени остается дискуссионным. Это связано с появлением данных о возможности реализации репаративного процесса за счет клеток, образующихся посредством отделения ядросо-держащей части симпластов. Значительную сложность представляет собой доказательство этого механизма, так как с момента отделения «ядерно-саркоплазмати-ческой территории» (если этот процесс реален], она становится неотличима по ультраструктуре от мио-сателлитоцита [2].

Высокодозная химиотерапия с последующей ал-логенной трансплантацией стволовых кроветворных клеток (СКК) часто является единственным способом радикального лечения значительного количества гематологических заболеваний. Основными источниками СКК для подобных процедур являются пунктаты костного мозга, периферическая кровь после предварительной мобилизации СКК и пуповинная кровь, богатая СКК per se. Пуповинная кровь в качестве источника СКК имеет ряд важных преимуществ. Во-первых, успех трансплантации СКК, полученных из пуповинной крови ШК-СКЮ, в отношении приживления последних и минимизации частоты и выраженности реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ] гораздо менее «требователен» к совпадению донора и реципиента по антигенам HLA. Так, опубликованный в 2007 г. сравнительный мета-анализ не выявил различий в общей двухлетней выживаемости и частоте развития острой РТПХ у пациентов, получавших ПК-СКК и пациентов, получавших СКК костного мозга [КМ-СКЮ несмотря на то, что трансплантаты ПК-СКК не совпадали с реципиентами по 1 или 2 антигенам HLA, а трансплантаты КМ-СКК полностью совпадали с реципиентом по всем антигенам HLA [1). Это означает, что шансы найти подходящего донора для пациента, которому показана аллогенная трансплантация СКК, намного повышаются. В то же время, существует определенная «количественная» проблема, затрудняющая использование ПК-СКК, а именно малое абсолютное число СКК в образцах ПК. Поскольку необходимое количество СКК рассчитывается на кг массы пациента, в детской практике подобной проблемы не стоит, однако в случае с взрослыми это приводит к задержкам восстановления кроветворения [в особенности тромбоцитарного ростка] и сравнительно частым отторжениям трансплантата. Был предложен ряд способов преодоления этого препятствия, а именно использование для трансплантации двух образцов ПК-СКК от различных доноров [2, 3), совместное введение ПК-СКК и очищенных CD34+ клеток от гаплоидентичного донора [4] либо мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток (5), а также предварительная экспансия ex vivo СКК С6).

Травма головного мозга СТГМ) до настоящего времени остается серьезной проблемой медицины. Фармакотерапия может замедлить нейродегенеративные процессы, сопутствующие повреждению, и частично снизить выраженность вызванных им симптомов, однако не способна привести к полному восстановлению когнитивных и моторных функций у пациента при тяжелой травме, а также обеспечить регенерацию нервной ткани в поврежденной области. Альтернативой лекарственным препаратам является клеточная терапия с применением различных видов стволовых клеток, способных продуцировать необходимые факторы роста и нейротрофины, дифференцироваться в нейроны и клетки глии, а также стимулировать пролиферацию и дифференцировку собственных нейропрогениторных клеток реципиента. Обзор посвящен анализу данных о существующих на сегодняшний день подходах к клеточной терапии ТГМ, при этом акцент сделан на трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток СММСЮ костного мозга.

В отличие от мультипотентных мезенхималыных стромаль-ных клеток костного мозга одонтобласты не являются клетками истинно мезенхимального происхождения и относятся к клеткам эктомезенхимы, которые развиваются из нервного гребня. Кроме маркеров нервной ткани, в частности - нестина, дифференцирующиеся одонтобласты зкспрессируют цитокератин 19. Нами была выдвинута гипотеза о том, что одонтобласты и их предшественники могут характеризоваться не только цито-кератинами, но и другими маркерами эпителия, с помощью которых станет возможно определить как сами предшественники [стволовые клетки) одонтобластов, так и их нишу. Для проверки этой гипотезы была изучена пульпа зубов человека (58 зубов), удаленных по ортодонтическим показаниям при воспалении пульпы или заболеваниях пародонта. Парафиновые срезы обрабатывали антителами, которые используются для выявления популяции стволовых клеток (c-kit, CD 31, CD 34) в том числе и в пульпе (a-SMA). Одновременно был проведен анализ экспрессии двух эпителиальных антигенов, которые широко используются для выявления эпителиальных клеток и дифференциальной диагностики опухолей (EMA, ESA). В нашем исследовании впервые показано, что одонтобласты как эктомезенхимные клетки зкспрессируют эпителиальные маркеры и, в частности, эпителиальный мембранный антиген.

Выполнено гистологическое исследование биоптатов (n = 52J слизистой оболочки подвздошной кишки, длительное время контактировавшей с мочой в составе мочевых резервуаров. Иммуногистохимическое исследование включало определение экспрессии энтероцитами маркеров клеточного цикла - Ki-B7, Вс12, р53. Установлено, что пролиферация эпителия активируется уже через 4-5 мес. после начала контакта с мочой. Процесс изменения пролиферативной активности включает три фазы - активацию - индекс пролиферации 70-86% (первый год]; стабилизацию на уровне 70% в течение второго года и повторный подъем в последующие сроки до 97%. Высказано предположение, что подобные изменения связаны с непосредственным влиянием на стволовые клетки кишечного эпителия. Уровень экспрессии Вс12, р53 оставался низким.

В пилотном клиническом исследовании изучали эффект системной [внутривенной] трансплантации кардиомиобластов, выращиваемых в культуре после обработки мезенхимальных стволовых клеток аутогенного костного мозга специфическим индуктором кардиомиоцитарной дифференцировки - 5-азаци-тидином, у 46 больных с хронической сердечной недостаточностью, получавших общепринятый курс медикаментозной терапии. Методика получения кардиомиобластов и мезенхимальных стволовых клеток была лицензирована Федеральным Агентством по надзору в области здравоохранения [лицензия ФС-200Б/20Б от 11 августа 2006 г.]. Было показано, что клеточная терапия с использованием аутогенных кардиомиобластов минимально инвазивна, не вызывает каких-либо осложнений [аллергических реакций, жизнеугрожающих аритмий, эмболии, тяжелых гемодинамических расстройств и др.] и не приводит к ухудшению состояния после ее проведения. В первые 3-6 мес. после системной пересадки клеток-предшественниц кардиомиоцитов у пациентов улучшалась сократительная способность и увеличивалась перфузия миокарда, что клинически проявлялось в уменьшении степени выраженности сердечной недостаточности с дальнейшей длительной стабильной компенсацией [до 1-2 лет наблюдения].

Прежде всего, мне от имени нашего научного коллектива хотелось бы поблагодарить рецензента за вдумчивый и высококвалифицированный анализ. Все поднятые рецензентом вопросы чрезвычайно важны для развития медицинских клеточных биотехнологий и заслуживают детального обсуждения. Вопрос 1. Почему в лечении пациентов, находящихся в состоянии комы, использовались клетки плодов 1Б-22 недельного срока гестации? На этих сроках удается получить стерильный клеточный материал со строго определенной тканевой принадлежностью в достаточном для трансплантации количестве. При выполнении стандартного аборта целостность плода чаще всего нарушается, и получение стерильного тканевого материала из мозгового пузыря представляется проблематичным. В большинстве стран, включая Россию, аборты не запрещены, их выполнение четко регламентировано законом. В настоящее время абортный материал либо утилизируется, либо используется для приготовления косметических препаратов. Использование абортного материала в лечении тяжелых заболеваний, прежде всего тех, которые приводят к тяжелой инвалидизации и не поддаются стандартному лечению, не может считаться неэтичным лишь потому, что это материал человеческого происхождения. Есть надежда на то, что человечество в будущем полностью отойдет от связанного с выполнением абортов варварского контроля над рождаемостью. Однако, даже в будущем, нельзя будет исключить возможность спонтанных абортов, которые, согласно имеющимся данным, могут являться источником полноценных стволовых клеток. Другим перспективным источником стволовых клеток являются эмбрионы, полученные в результате экстракорпорального оплодотворения. В настоящее время активно разрабатываются технологии получения из эмбриональных клеток органных клеточных культур, предназначенных для ремонта «больных» органов. Получение таких культур нельзя путать с клонированием человеческого организма, которое встречает вполне понятное критическое отношение определенных слоев общества. Таким образом, возможность использования феталь-ных и эмбриональных стволовых клеток в медицине несет в себе колоссальные лечебные перспективы, и этот вопрос заслуживает, с нашей точки зрения, самого интенсивного исследования.

Институт стволовых клеток человека, издатель журнала «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия», сообщает об учреждении премии за лучшую публикацию 2008-2009 годов. Лучшая публикация будет выбираться участниками Редакционного совета, в состав которого входят признанные специалисты, после выхода третьего номера за 2009 год, т.е. осенью-зимой 2009 года. Спонсором этой премии стал ГЕМАБАНК - банк стволовых клеток, расположенный на базе ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина. У нас есть твердое мнение, что наш журнал даст положительный импульс к развитию науки в области клеточных технологий, откроет новые возможности для молодых специалистов, предоставит максимально полезную информацию для тех, кто вовлечен в эту область и интересуется ею. Редакция всемерно приветствует участие в создании и развитии журнала специалистов, которые уже работают в области клеточных технологий, молодых ученых, которые только начинают исследовательскую карьеру. Премия за лучшую публикацию учреждается в размере ВО тысяч рублей. Мы готовы сотрудничать со спонсорами, которые хотели бы принять участие в развитии новых направлений медицинской науки и стать коспонсорами этой премии.