Human placenta as a source of hematopoietic stem cells

Full Text

Введение

Плацента - провизорный орган, осуществляющий связь между организмом матери и плодом в процессе внутриутробного развития. Помимо выполнения известных фундаментальных функций, плацента млекопитающих представляет собой богатый резервуар гемопоэтических стволовых клеток [ГСК]. В процессе онтогенеза происходит миграция очагов гемопоэза. К настоящему времени наиболее детально исследованы процессы плацентарного гемопоэза у мышей, который во многих отношениях может служить моделью кроветворения у человека.

У мыши эмбриональный гемопоэз начинается после гаструляции, когда группа специализированных мезодермальных клеток-предшественников [гемангиобластов] коммитируется на путь гемопоэза. Первые кроветворные предшественники мигрируют в стенку желточного мешка и инициируют продукцию эмбриональных «красных кровяных телец». Существуют данные, что дефинитивные ГСК, возможно, происходят из другой группы мезодермальных клеток [1]. Множество исследований свидетельствует о том, что мезенхима участка эмбриона, обозначаемого как «аорта-гонады-мезонефрос» [АГМ], который ограничен дорзальной аортой и урогенитальными гребнями, является источником ГСК [2-5]. Дополнительно ГСК формируются в пуповинной и вителлиновой артериях [6]. Эти ГСК, вероятно, колонизируют развивающуюся печень, которая служит основным органом кроветворения уже в плодном периоде. Несмотря на прогресс в идентификации ГСК в зародышевых органах, до сих пор мало известно о происхождении различных пулов ГСК и их относительном вкладе в гемопоэз. Так, до 2003 года оставалось не выясненным, являются ли клетки АГМ единственным источником быстро растущего пула ГСК фетальной печени [7]. Новые перспективы в решении этого вопроса появились в связи с обнаружением в мышиной плаценте на средних сроках гестации многочисленных мультипотентных клеток-предшественников и ГСК, что указывает на важную роль плаценты в становлении гемопоэза [8-Ю]. Еще в 70-е годы XX века было показано, что предшественники В-клеток появляются в плаценте мыши перед тем как попасть в печень [11]. Клетки, обладающие способностью генерировать В-лимфоциты, обнаруживались в плаценте на стадии Э9.5, их число достигало максимума на Э12.5 и затем снижалось, аналогичную кинетику демонстрировала и популяция ГСК [9]. Так, к концу внутриутробного развития количество ГСК в плаценте у мышей снижается, что, возможно, является отражением процесса миграции плацентарных ГСК в печень и другие развивающиеся кроветворные органы плода [тимус, селезенку и костный мозг]. Накопленные данные позволяют предположить, что плацента может функционировать как орган лимфо- и миелопоэза.

Цель нашего исследования состояла в оценке человеческой плаценты как потенциально возможного источника ГСК в процессе естественного гемопоэза.

Материал и методы

Зрелые плаценты человека были получены в Госпитале Альта Бэйтс [Бэркли, Калифорния, США] с согласия доноров. Иммуногистохимические исследования тканей плаценты на присутствие CD34 и других маркеров ГСК - CD90, CD3S, CD133 проводили на срезах с парафиновых блоков, методом иммунофлюоресценции после обработки протеиназой К.

На первом этапе проводили перфузию плацент через артерии и вену пупочного канатика раствором антикоагулянта и сосудорасширяющего агента. Далее, для выделения клеток, в артериальное русло вводили 50 мл физиологического раствора на фосфатном буфере с антибиотиками [пенициллин, стрептомицин и фунгизон], протеазами [диспаза (2,5 ед./мл), трипсин (0,5 мг/мл)] и ЭДТА. Образцы тканей плаценты измельчали и помещали в буфер с коллагеназой I (0,1%) и диспазой (2,5 ед./мл) на 30 мин при 37°С. Полученные таким образом образцы перемешивали и фильтровали через фильтр с размером пор 100 мкм в течение 5 мин.

Для получения мезенхимальных стволовых клеток (МОК), тканевый лизат центрифугировали при 400д в течение 1 5 мин., удаляли супернатант. Культивирование проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [12].

Часть плацент криоконсервировали по следующей схеме. Плаценты промывали 250 мл буферного раствора [см. выше], затем проводили перфузию раствором смеси криоконсервантов [пропилен гликоль [15%], DMSO [14%], Formamide [14%] и др. в течение 40 мин. Затем плаценты замораживали в морозильной камере [-80°С] в течение 12 часов, после чего помещали в жидкий азот.

Количество CD34⁺клеток в гомогенахы тканей определяли с помощью проточного цитофлюориметра FACScaliber [BD Bioscences, San Jose, CA] с использованием Procount Progenitor Cell Enumeration Kit [BD Bioscences]. Выделяли CD34/CD45 положительную популяцию клеток. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ядерно-цитоплазматического окрашивания То-Рrо.

Дифференцировочный потенциал клеток оценивали с использованием полной среды MethoCult® на основе метилцеллюлозы [Stem Cell Technologies, Canada). Присутствие клеток-инициаторов долговременно поддерживающихся культур определяли с использованием фидерного слоя из стромальных клеток плацентарного происхождения от того же донора. Для инактивации фидера культуру обрабатывали раствором митомицина С (10 мкг/мл) (Sigma, St.Louis, МО) в течение 2 часов.

В экспериментах с трансплантацией полученных клеток использовали иммунодефицитных мышей двух линий (Jaxon Laboratories, Bar Harbor, Maine): необлученных NOD.Cg- Prkdc^scid H2rg^tmWjlSzJ (JaxLab Cat. № 005557) и целиком облученных (2,5 Gy) NOD.Cg-Rag1^tm1Mom Prf1^tm1Sdz/Sz (JaxLab Cat. № 004848). Всем мышам внутрибрюшинно вводили 10⁶ ядросодержащих клеток, выделенных из плацентарных тканей. Через 2-3 мес. после трансплантации животных выводили из опыта и производили иммуноокрашивание клеток крови, костного мозга и селезенки антителами к человеческим CD45 (общий лейкоцитарный маркер), CD3 (лимфоцитарный маркер), CD25 (лимфоцитарно/моноцитарный маркер) и CD51/CD61 [маркеры тромбоцитов/ мегакариоцитов]. Подсчет клеток проводили с помощью проточной цитометрии с использованием соответствующих негативных (мыши без трансплантации) и позитивных контролей (человеческая кровь).

Результаты

В исследовании мы уделили основное внимание двум классическим маркерам человеческих ГСК: CD133 и CD34. Известно, что примитивные ГСК, гемопоэтические клетки-предшественники и гемангиобласты экспрессируют CD133. CD133⁺ клетки костного мозга эффективно заселяются в ткани иммунодефицитных мышей, и эта популяция CD133⁺ ГСК содержит предшественники гранулоцитов/макрофагов. Популяция CD133⁺ в костном мозге и крови коэкспрессирует CD34.

У человека колониеформирующая активность характерна для популяции CD34⁺ клеток, которые способны к колонизации и репопуляции кроветворных органов иммуннодефицитных мышей. Популяция CD34⁺ клеток костного мозга содержит ГСК, которые поддерживают гемопоэз в течение всей жизни организма.

Иммуногистохимическое исследование тканей плаценты показало присутствие многочисленных кластеров CD34⁺ клеток, не связанных с микроциркуляторным руслом, локализованных в свободной соединительной ткани (рис. 1). Количество CD34⁺ клеток составляло 0,2±0,03% всех клеток плаценты, их общее число в среднем составляло 2,5х10⁷ клеток на плаценту. Была отмечена колокализация CD34 и других классических маркеров ГСК - CD90, CD38, CD133 (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Кластеры CD34+ клеток, не связанные с микроциркуляторным руслом в тканях плаценты. Иммуноокрашивание на CD34, CD38, CD90, и CD133. А1 — CD34 (зеленый), CD90 (красный), и ядра [голубой]. Белые стрелки указывают на CD34+CD90+ клетки; зеленая — на CD34+CD90- клетки; красная — CD34+ эндотелиальные клетки капилляра. A2 — CD34 (зеленый), CD38 [красный], и ядра [голубой]. Стрелки указывают на CD34+CD38+ клетки. A3 — CD34 (зеленый), CD133 [красный], и ядра [голубой]. Стрелки указывают на CD34+CD133+ клетки. Б — FACS-диаграммы клеток пуповинной крови и тканей плаценты, окрашенных на жизнеспособные CD34+CD45+dim клетки. Б1 — Диаграмма клеток тканей плаценты; абсцисса - окраска ТоРrо-3; ордината - side scatter. Точки, расположенные справа от границы, обозначают погибшие клетки. Б2 — Жизнеспособные ядросодержащие клетки диаграммы Б1, окрашенные на CD34 и CD45. БЗ — Клетки пуповинной крови, окрашенные ТоРrо-3 на жизнеспособность. Б4 — CD34+CD45+dim окраска жизнеспособных клеток с диаграммы БЗ. В1 — Количество CD34+ клеток в тканях свежей и криоконсервированной плаценты и пуповинной крови на единицу объема (μl). B2 — Общее количество CD34+ гемопоэтических стволовых клеток в свежей плаценте (СП), криоконсервированной плаценте [КП] и в пуповинной крови [ПК]

 

Сравнительный анализ пуповинной крови и препаратов, полученных после обработки плаценты протеолитическими ферментами, показал гораздо более высокий выход живых, CD45^dimQ034+ клеток из плаценты. Общее количество ГСК, доступных в препарате плаценты, по сравнению с общим объемом пуповинной крови из этого же источника, было в среднем в 10-12 раз выше (см. рис. 1).

Иммуногистохимическое исследование также показало присутствие многочисленных кластеров CD133⁺ клеток, локализованных в свободной соединительной ткани (рис. 2). Среди этих кластеров выявлялись очаги эритропоза.

 

Рис. 2. СD1ЗЗ-положителычые клетки тканей плаценты: А — CD133 [зеленый] и ядра [голубой]. Скопления CD133+ клеток, не связанных с микроциркуляторным руслом матери или плода: Б — гистограмма FACS анализа тканей плаценты на наличие CD133 положительных клеток. Ордината — относительное число клеток, абсцисса — интенсивность флуоресценции из выборки, показанной на точечной диаграмме; В — очаги эритропоэза в мезенхиме плаценты: В1 – CD133 [зеленый]; В2 — ядра [голубой]: ВЗ — гемоглобин [красный]: В4 — совмещенное изображение В1, В2, и ВЗ. Красная стрелка указывает на скопление CD133+ гемопоэтических стволовых клеток. Белая стрелка указывает на пикнотическое ядро. Оранжевая стрелка указывает на энуклеирующий эритробласт; розовая стрелка указывает на мигрирующие эритроциты

 

Гистологические и цитометрические данные свидетельствуют о том, что плацента является очень богатым источником CD34⁺ и CD133⁺ ГСК. Для того, чтобы убедиться в жизнеспособности и дифференцировке ГСК после обработки ткани протеиназами, мы оценили способность клеток к дифференцировке в клетки крови, используя стандартные тесты на колониеобразование, включая CFLI-E, BFLI-E, CFLI-GM, CFU-GEMM, результаты сравнивались с такими же тестами в отношении ГСК пуповинной крови. Между числом колоний, образованных одинаковым количеством клеток плаценты или клеток пуповинной крови из той же плаценты, не было выявлено статистически значимой разницы. Клетки, растущие в MethoCult® в течение 14 дней, были позитивны в отношении гемоглобина, CD45, CD25, CD31 (маркера В-лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов), CD11b (маркера моноцитов и гранулоцитов) и CD69 (маркера макрофагов) (рис. 3).

 

Рис. 3. Результаты культивирования клеток тканей плаценты в среде MethoCult® (Stem Cell Technologies, Canada): A — колонии эритроидных предшественников (CFU-E - colony forming unit erythroid), BFU-E (burst-forming unit erythroid), гранулоцитов и макрофагов (CFU-GM-colony forming unit-granulocyte, macrophage), CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte, erythroid, macrophage, megakaryocyte); Б — фенотип колоний после 6 недель культивации на фидерных культурах и 2 недель в среде MethoCult®: Б1 — колония CFU-E; Б2 — колония CFU-GEMM; В — колония эритробластов-эритроцитов. Окраска на гемоглобин бензидином (Sigma, США): В1 — клетки из тканей плаценты; В2 — клетки из пуповинной крови; Г-Ж — колонии, окрашенные на маркеры лейкоцитов, окраска ядер DAPI (голубой); Г — Окраска на CD11b; Д — окраска на CD31; Е — окраска на CD69; Ж — негативный контроль

 

Для того, чтобы показать присутствие среди первичных плацентарных клеток клеток-иниицирующих долговременную гемопоэтическую культуру, первичные плацентарные клетки культивировали в течение 6 нед. на фидерном слое из стромальных клеток, выделенных из тех же образцов плаценты. В этом случае ГСК активно дифференцировались в среде MethoCult®, что доказывало присутствие клеток- инициаторов долговременной культуры среди первичных плацентарных клеток.

У иммунодефицитных мышей NOD/SCID, получивших сублетальную дозу облучения, введение плацентарных CD34⁺ ГСК приводило к появлению в костном мозге, селезенке и периферической крови CD45⁺CD3⁺ лимфоцитов. Химеризм (присутствие человеческих клеток крови) достигал 9-12%, составляя в среднем 3±1%. Наблюдалось присутствие CD45⁺CD29⁺ клеток, а также CD45⁺CD51⁺/ CD69⁺ клеток.

Аналогичные исследования после криоконсервации плацент и хранения в течение 1-3 мес. показали сходные результаты. Удалось получить такое же количество жизнеспособных CD34⁺ клеток, сохранивших способность к дифференцировке.

Обсуждение

Полученные результаты показывают, что плацента человека содержит чрезвычайно большое количество гемопоэтических клеток-предшественников. Из плацентарных тканей человека можно получить большее количество CD34⁺ ГСК, чем из пуповинной крови. Эти клетки сохраняют свои способности к прогрессивной дифференцировке по пути лимфо- и миелопоэза после криоконсервации.

В некоторых исследованиях на мышах показано, что плацента в 2-4 раза богаче ГСК, чем даже фетальная печень [8, 13]. На стадии Э9 и Э10 в плаценте уже присутствовали ГСК, в то время как в печени их еще не было.

Особенностью плацентарных ГСК является быстрое увеличение их численности в период между Э11.5 и Э12.5 [9]. В результате чего в этот период содержание ГСК в плаценте более чем в 15 раз превышает численность ГСК в АГМ или в желточном мешке, что, возможно, говорит об уникальном кроветворном микроокружении, которое существует в плаценте. Увеличение пула ГСК в период Э11.5-Э12.5 было более выраженным, чем увеличение соответствующего пула клоногенных клеток-предшественников, что свидетельствует о том, что плацентарное микроокружение способствует поддержанию ГСК без одновременной дифференцировки в последующие кроветворные классы [9]. Количество гемопоэтических клеток в плаценте на средних сроках гестации [соответствующих примерно 1-2 месяцам гестационного возраста человеческого эмбриона] во много раз превосходит их количество в зрелой плаценте, пуповинной крови и циркулирующей крови in toto. Данные результаты показывают, что плацента является ранее недооцененным источником ГСК.

В настоящее время основными источниками ГСК для трансплантации в клинической практике служат костный мозг, периферическая и пуповинная кровь. Но потребность в HLA-совместимых стволовых и прогениторных кроветворных клетках превышает возможность по их заготовке. Менее чем 30% потенциальных реципиентов имеют HLA-идентичных родственников, в связи с чем широко распространенной является пересадка аллогенных ГСК костного мозга, которая часто приводит к неблагоприятным реакциям со стороны иммунной системы. Кроме того, не следует забывать и о главном ограничении использования человеческой пуповинной крови для трансплантации - низкое содержание в ней ГСК, недостаточное для обеспечения адекватного восстановления гемопоэза у взрослых реципиентов [14].

Результаты нашей работы с очевидностью показывают, что криоконсервирование плаценты с помощью перфузии и последующего замораживания может являться альтернативным и эффективным способом сохранения аутогенных кроветворных стволовых клеток в количестве, достаточном для реконституции гемопоэза взрослых пациентов.

About the authors

V. Serikov

Children's Hospital Oakland Research Institute

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
United States, Oakland

F. Kuypers

Children's Hospital Oakland Research Institute

Email: info@eco-vector.com
United States, Oakland

References

Supplementary files