Vol 4, No 4 (2009)

Исследования стволовых клеток (СК) и прогениторных клеток эпителия дыхательных путей млекопитающих характеризуются определенной спецификой: слишком часто экспериментальные результаты не дают ясного ответа на поставленные вопросы. В этом плане показательна работа коллектива авторов из Duke University, опубликованная в июньском номере Cell Stem Cell [1]. Исследование посвящено степени участия в постнатальном росте, поддержании гомеостаза и репарации повреждений эпителия легких мыши нереснитчатых бронхиолярных клеток, называемых клетками Клара. Известно, что после окончания постнатального роста ткань эпителия легких переходит в стационарное состояние с очень низкой скоростью обновления клеток. Повреждение же эпителия стимулирует его быстрое восстановление и обновление. Попытки выявить резидентные соматические СК или прогениторные клетки эпителия легких до сих пор приводили к получению неоднозначных результатов.

Митохондриальные болезни представляют собой одну из наиболее распространенных групп наследственных болезней человека и встречаются с частотой один случай на 3,5-6 тысяч человек [1]. В основном, они характеризуются поражением нервной и мышечной системы, благодаря чему появилось их другое название - митохондриальные миопатии [2]. Причина данных болезней лежит в мутациях митохондральной ДНК, которые в большинстве случаев негативно влияют на биосинтез белков, задействованных в энергетическом метаболизме клетки. Этим и объясняется негативное влияние миохондриальных болезней, большей степенью на нервную и мышечную системы, так как клетки данных систем характеризуются высокой интенсивностью выработки и потребления энергии, и, соотвественно, они наиболее чувствительны к патологическим изменениям энергетического обмена. К настоящему времени не существует эффективных лекарственных средств для терапии данной группы заболеваний, а все доступное лечение носит симптоматический характер. Профилактика митохондриальных болезней при искусственном оплодотворении сводится к генетическому анализу митохондриальной ДНК в рамках предымплантационной генетической диагностики и имплантации эмбрионов, которые не несут соответствующих мутаций в митохондриальном геноме [3].

Регенерация скелетных мышц имеет важное клиническое значение при мышечных дистрофиях и различных травмах, и зависит от камбиального резерва, формируемого клетками-миосателлитами. Как формирующие скелетное мышечное волокно миобласты, так и клетки-миосателлиты образуются из единых мышечных предшественников с высоким пролиферативным потенциалом [2]. После завершения формирования мышечного волокна во время эмбрионального развития скелетной мышцы клетки-миосателлиты располагаются вне многоядерного волокна и остаются пролиферативно-неактивными. Выживание и распространение этих клеток основано на экспрессии транскрипционного фактора Pax7 [2]. Исследования in vitro подтверждают важную роль Pax7 в процессах выживания миобластов, их пролиферации и установлении миогенного фенотипа [1-2]. Также было показано, что в покоящихся клетках-миосателлитах наблюдается постоянная экспрессия Pax7 [3]. Основываясь на этих данных, исследователи из отдела эмбриологии института Карнеги Christoph Lepper и Chen-Ming Fan решили проверить гипотезу о том, что влияние Pax7 ответственно за самообновление и вызванную травмами регенерацию скелетных мышц in vivo.

Применение тканеинженерных конструкций на основе клеток-предшественниц кардиомиоцитов считается перспективным подходом в лечении пациентов, перенесших инфаркт миокарда, однако исследования в этой области пока ограничиваются доклиническими экспериментами на животных. В течение последних двух лет были опубликованы работы, в которых сообщается о создании жизнеспособных эквивалентов миокарда человека на основе кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека. Кардиомиоциты вводили в сердечную мышцу экспериментальных животных с индуцированным инфарктом миокарда. Тем не менее, образовавшиеся in vivo фрагменты миокарда состояли из малого количества клеток, большая часть которых со временем гибла [1-3]. Предварительное помещение трансплантируемых клеток на обеспечивающие их адгезию трехмерные матриксы увеличивает срок жизни и возможные размеры трансплантата [4, 5]. Однако, у подобных тканеинженерных конструкций есть другие недостатки, связанные с недостаточной биосовместимостью, неоптимальными механическими и другими характеристиками различных матриксов.

Рак легких - одна из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний, а на долю немелкоклеточного рака легких приходится в среднем от 75 до 80% всех случаев рака легких в мире [1, 2]. Пятилетняя выживаемость больных с данной патологией составляет около 50%, и до настоящего времени не разработано терапевтического подхода, который смог бы увеличить этот срок. Хирургический метод лечения, а также радио- и химиотерапия оказываются при немелкоклеточном раке легких низкоэффективными [3]. В последние годы исследователи и клиницисты возлагают большие надежды на принципиально новый подход к борьбе с онкологическими заболеваниями - генную терапию. К настоящему времени уже получен ряд многообещающих результатов генной терапии в доклинических и клинических испытаниях [4-6]. К началу 2005 г. в мире было проведено более 600 клинических испытаний применения генной терапии в лечении онкологических больных [7]. В числе агентов генной терапии выступали вирусные векторы, несущие ген опухолевого супрессора p53 (rAd-p53). В этих клинических испытаниях была продемонстрирована безопасность использования rAd-p53 как в качестве единственного терапевтического агента, так и в сочетании с традиционной химиотерапией, однако эффективность данного подхода однозначно доказана не была [8-11]. В 2003 г. препарат rAd-p53 (коммерческое название - Gendicine®) был разрешен Министерством Здравоохранения Китая для применения при плоскоклеточном раке кожи [12].

Коллаген I типа широко применяется в медицине и биотехнологии в связи с относительной простотой получения и своими биологическими свойствами. Целью работы стало изучение пролиферации (индекс пролиферации), распластывания (актиновый цитоскелет, площадь распластывания) и остеогенной дифференцировки (наличие внутриклеточной щелочной фосфатазы) стромальных клеток костного мозга (CKKM) крысы на различных молекулярных и фибриллярных коллагеновых субстратах на плоскости и при трехмерном культивировании в гелях коллагена. Препараты коллагена получали из шкур овцы или молодых быков методом щелочно-солевой экстракции. Контрольный коллаген был получен с помощью кислотной экстракции из хвостов крыс. Фибриллы коллагена на плоскости получали путем трехразового последовательного нанесения на подложку слоев молекулярного коллагена. Исследовали способность к желированию (образованию геля) препаратов коллагена в нейтральной среде при 37°С. СККМ беспородных крыс получали центрифугированием на градиенте гистопака плотности 1,077 г/мл и культивировали в ростовой среде. Актиновый цитоскелет распластанных клеток окрашивали с помощью родамин-фаллоидина. Локализацию раннего маркера остеогенной дифференцировки - щелочной фосфатазы - выявляли гистохимически с помощью окраски клеток смесью, содержащей тетразолиевый синий. В ходе работы было установлено, что желирует не только контрольный коллаген из хвостов крысы, но и один из препаратов коллагена из шкур овец. В дальнейшем мы сравнивали поведение клеток на желирующих и нежелирующих препаратах коллагена. Наибольшие площадь распластывания, индекс пролиферации и выработка щелочной фосфатазы были у СККМ на желирующих фибриллярных коллагенах. Оба коллагена давали устойчивые гели, в которых клетки сохраняли способность к остеогенной дифференцировке до двух недель. Гелеобразующий образец коллагена I типа из шкур овец можно рекомендовать для применения в качестве носителя при трансплантации СККМ.

Цель исследования - анализ механизмов остеогенеза при замещении костных дефектов у лабораторных животных искусственными и натуральными биоматериалами самостоятельно и в составе тканеинженерных конструкций (ТИК) с аутогенными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК). В работе использовали гранулированные (у крыс) и цельные (у баранов) синтетические биоматериалы: пористую биокерамику на основе карбонатгидроксиапатита (КГА), биокомпозит - высокопористый матрикс из среднемолекулярного хитозана, армированный гранулами КГА, и натуральный коралл (НК) сем. Асгорога. Создавали дефекты: ограниченный - остеотомия голени крысы и критический - сегментарная резекция бедренной кости барана. Для получения ТИК аутогенные ММСК животных (II-IV пассаж) переносили на образцы материалов и культивировали в течение 7-10 (крысы) и 14-21 (бараны) сут. Оперативные вмешательства проводили под общей анестезией. В стандартные сроки животных выводили из эксперимента, область дефекта с окружающими тканями фиксировали и декальцинировали. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и проводили световую микроскопию. Закрытие костного дефекта у животных при имплантации перечисленных материалов происходит путем периостального остеогенеза и завершается в сроки 6-12 мес. Компактная костная ткань у крыс образуется уже через 9 нед. после операции. У барана через 6 мес. вещество НК замещается компактной костной тканью с формированием органотипических структур (остеонов). Использование ТИК с аутоММСК значительно ускоряет процессы репаративной регенерации за счет активации, помимо периостального, - энхондрального механизма остеогенеза. Использование ТИК с аутогенными ММСК на основе искусственных керамических, композиционных и натуральных материалов в гранулированной форме или в виде цельных имплантатов существенно сокращает сроки замещения костных дефектов за счет того, что дополнительно к периостальному включается энхондральный остеогенез, что приводит к образованию костной ткани de novo по всему объему дефекта и в итоге - органотипическому замещению дефекта.

Разработана технология приготовления культур стволовых и прогениторных клеток (СПК) из нейрогенных зон мозга человека и животных. Определен оптимальный состав среды для пролиферации нейральных СПК, выращиваемых суспензионным способом в виде нейросфер. Дана морфологическая и фенотипическая характеристика культивируемых клеток с использованием моноклональных антител к маркерам стволовых, прогениторных и зрелых клеток. Установлена способность к росту и накоплению биомассы СПК в течение 3-х пассажей. Проведена сравнительная оценка интенсивности роста нейросфер, полученных из разных областей мозга человека и животных. Выявлен более интенсивный рост СПК животных из субэпендимной зоны желудочков мозга и обонятельной луковицы.