Vol 4, No 2 (2009)

Одним из важнейших вопросов, неразрывно связанных с изучением гемопоэтических стволовых клеток [ГСЮ, является установление морфофункциональной организации их костномозговых ниш - сложного комплекса взаимосвязанных клеточных и неклеточных элементов, регулирующих процессы пролиферации, диф-ференцировки и миграции ГСК И, 2]. Необходимость решения этой теоретической проблемы продиктована, в первую очередь, запросами практической медицины, касающимися, например, разработки и оптимизации безопасных предтрансплантационных мероприятий при пересадке костного мозга.

Длительное время полагали, что способность запоминать события и факты в основном обеспечивается пластичностью синаптических контактов между нейронами. Поэтому обнаружение у млекопитающих непрерывного нейрогенеза в субгранулярной зоне зубчатой извилины СЗИ) гиппокампа - области, которой приписывают первостепенную роль в формировании пространственной и декларативной памяти [1], - оказалось весьма неожиданным. Действительно ли образование новых нейронов способствует запоминанию событий? Ответ на этот вопрос до сих пор не был получен. Различные математические модели позволили сделать вывод о том, что без добавления новых нейронов информация может «записываться» только «поверх» старой, тем самым стирая предыдущую память [2]. С другой стороны, влияние нарушенного нейрогенеза на успех выполнения классических поведенческих тестов, которые были разработаны для оценки «гиппокампальной» памяти, оказалось неоднозначным [3-7]. По-видимому, эти противоречивые результаты связаны с тем, что формирование новых нейронов необходимо для выполнения лишь некоторых функций из тех, которые исторически приписываются гиппокампу. Более того, часть таких функций может быть еще не описана.

Наряду с экспериментальными исследованиями, направленными на использование дифференцировочных потенций мезенхимальных мультипотентных стромаль-ных клеток СММСК), активно разрабатывается направление, занимающееся вопросом возможности применения принципиально иного свойства ММСК - воздействия на иммунную систему [1, 2]. В целом, результаты различных исследований свидетельствуют, что для ММСК характерны иммунорегуляторные потенции, реализующиеся через супрессию образования и активации ТЫ -хел-перов [3], натуральных киллеров [4] и В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию [5], ингибирование дифференцировки и функции дендритных клеток [В], увеличение пула регуляторных Т-клеток [7]. В этой связи ММСК применяются для ослабления реакции «трансплантат против хозяина» [8], а также исследуется возможность их применения при аутоиммунных заболеваниях [9, 10].

До недавнего времени считалось, что образование овогоний в яичниках млекопитающих прекращается до рождения [1-5], однако еще в 2004 г. было показано, что у новорожденных и взрослых мышей яичники способны к восстановлению численности овогоний после экстремальных воздействий [В]. Впоследствии появились предположения о том, что источником этой регенеративной способности могут быть клетки костного мозга и периферической крови, мигрирующие в яичник [7]. Но эти предположения были опровергнуты [8]. Исследователи до сих пор не утвердились во мнении относительно того, какие именно клетки ответственны за восстановление численности фолликулов, и существуют ли в яичниках камбиальные элементы, способные восстанавливать популяцию овогоний [Б, 8-11]. Научная группа К. Zou из Шанхайского Университета [Китай] провела исследование, подтвердившее, что в яичниках мышей, и, возможно, других млекопитающих, присутствуют стволовые клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в функциональные овоциты. С помощью иммуногистохимического анализа было показано, что в тканях яичников новорожденных и взрослых мышей присутствуют клетки, положительные по маркеру MVH [mouse vasa homologue], который экс-прессируется исключительно в клетках зародышевого пути. По крайней мере, часть этих клеток постоянно и активно пролиферировала: через 1 час после введения пятидневным и взрослым животным маркера пролиферации 5'-бромдезоксиуридина [BrdU) из эпителия их яичников были выделены клетки, несущие двойную метку - BrdU и MVH. Используя магнитную клеточную сепарацию [MACS], исследователи получили из яичников новорожденных и взрослых мышей MVH+ клетки [при этом количество таких клеток в яичнике новорожденной мыши составило от 200 до 300, а в яичнике взрослого животного - от 50 до 100 клеток). Это были крупные клетки со сферическим ядром диаметром от 12 до 20 мкм, содержащим большое количество нуклеоплазмы, морфологически напоминающие сперматогонии типа А [12]. Чтобы определить, содержит ли популяция MVH+ клеток in vitro делящиеся клетки, в среду их культивирования был добавлен BrdU. Оказалось, что BrdU-позитивные клетки действительно присутствуют. В течение 7 пассажей количество клеток в культуре существенно увеличивалось, при этом формировались компактные колонии.

В последнее десятилетие стало известно, что в специфических областях уже сформировавшегося мозга может происходить ограниченный нейрогенез. Клетки-предшественницы из этих областей, способные дифференцироваться в нейроны и глиальные элементы, в перспективе могут использоваться в клеточной терапии нейродегенеративных расстройств [1-4]. Многообещающим источником нейральных стволовых клеток [НСЮ для клеточной терапии считается фетальный мозг, в котором активно происходят процессы нейрогенеза [5]. НСК могут стать незаменимым средством в лечении нейродегенеративных заболеваний, последствий инсульта и травмы головного мозга [1-4, В-9], а также применяться в терапии детей, страдающих врожденными генетическими заболеваниями, характеризующимися гибелью специфических типов нейронов [1, 5]. Одним из таких заболеваний является атаксия-те-леангиэктазия [синдром Луи-Бар] - аутосомное рецессивное наследственное заболевание, для которого характерна прогрессирующая гибель клеток Пуркинье в мозжечке [и, как следствие, атаксия], телеангиоэкта-зия [расширение кровеносных сосудов], врожденная ангиопатия, иммунодефицит, возрастание числа хромосомных аберраций в соматических клетках, высокая частота онкологических заболеваний и повышенная чувствительность к ионизирующей радиации и радиомиметическим веществам. Причиной данного заболевания является мутация в гене амелогенина atm [10]. В то же время применение фетальных нейральных клеток-предшественниц, несмотря на успех уже состоявшихся клинических испытаний [11], имеет и негативный аспект: существует вероятность возникновения из этих клеток злокачественных новообразований [2, 3]. Введение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток [ЭСЮ и полученных из них нейральных стволовых клеток грызунам часто приводит к формированию тератом и тератокарцином [В, 12, 13]. При этом тумо-рогенность клеток снижается с повышением степени их дифференцированности [7, 8, 14]. Важно отметить, что ЭСК чаще провоцируют опухоли при внутривидовой, чем при межвидовой трансплантации, что также было подтверждено трансплантациями ЭСК человека грызунам [2, 11 ]. Недавно был описан клинический случай развития мультифокальной опухоли из трансплантированных пациенту с атаксией-телеангиэктазией фетальных НСК. В феврале 2009 г. научная группа N. Amariglio опубликовала в журнале PLoS Medicine статью, в которой сообщается о 13-летнем пациенте, получившем троекратную трансплантацию фетальных нейронов в одной из клиник Москвы [авторы не сообщают, в какой именно клинике проводились операции]. Трансплантации производились, когда пациенту было 9, 11 и 12 лет, а клетки для них были получены и культивированы по протоколам Р.А. Пол-тавцевой и соавт. [15].

Обзор посвящен актуальному биомедицинскому направлению в заместительной клеточной терапии - терапевтическому клонированию, которое является наиболее универсальным подходом для получения пациент-специфичных линий эмбриональных стволовых клеток СЭСЮ с колоссальными возможностями в поддержании и восстановлении здоровья человека. В обзоре также представлены альтернативные подходы и тенденции в получении ЭСК человека, которые, в отличие от терапевтического клонирования, пока далеки от выхода в клиническую практику. Уникальная ценность ЭСК в лечебных целях определяет серьезную потребность в развитии терапевтического клонирования и в нашей стране.

В настоящее время внимание клиницистов привлекает возможность использования методов клеточной терапии и, в частности, ядросодержащих клеток пуповинной крови человека (ЯСК ПК] для лечения ряда патологических состояний. Интересными представляются разнообразные экспериментальные модели исследования свойств человеческих ЯСК ПК, введенных животным. Поскольку патогенетической основой многих заболеваний является гипоксия, целью настоящего исследования явилось изучение в эксперименте возможных корригирующих свойств ЯСК ПК при острой гемической гипоксии. Экспериментальные исследования выполнены на 24 неинбредных белых крысах-самках, разделенных на 3 группы: 1-я группа - кровопотеря 30% ОЦК без лечения, 2-я группа - кровопотеря 30% и введение ЯСК ПК и 3-я группа - интактные животные [контроль]. Ядросодержа-щие клетки из ПК человека выделяли методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина, отмывали и разводили до10в кл/мл в 1 мл физиологического раствора, исходя из чего доза ЯСК составила в среднем 4х10Б на 1 кг массы тела животного. Введение ЯСК ПК проводили через 3 часа после создания кровопотери, все показатели исследовали на 5-е сутки после острой гемической гипоксии. На 5-й день наблюдения у животных подопытных групп было отмечено достоверное по сравнению с контролем снижение уровня гемоглобина и эритроцитов. Однако в группе, получившей ЯСК, показа тели красной крови достоверно превышают таковые у крыс с нелеченной анемией. Интересно, что число лейкоцитов в группе, получившей ЯСК ПК, было выше не только по сравнению с параллельной группой, но и с контролем. По данным биохимического анализа крови, метаболические нарушения практически отсутствовали в группе, получившей ЯСК ПК, тогда как у крыс 1-й группы на 5-е сутки они сохранялись. Результаты исследования поведенческой активности самок по тестам «открытое поле», «грумминг» и «норковый рефлекс» продемонстрировали статистически значимое снижение двигательной и эмоциональной активности животных вследствие кровопотери, тогда как у животных, получивших ЯСК, наблюдалась не только нормализация параметров, но даже относительная активизация в 85% случаев! Приведенные результаты свидетельствуют в пользу выраженного антигипоксического эффекта ЯСК ПК, выяснение механизма которого требует дальнейших исследований.

Восстановление поврежденных тканей является одной из важнейших проблем лечения пациентов с обширными и глубокими ожогами, трофическими язвами, другими травматическими повреждениями. Есть предположение, что разработанные ранее коллаген-хитозановые матрицы, содержащие гликозами-ногликаны и факторы роста, и применение их с мультипотент-ными клетками позволят создать дермально-эпидермальный эквивалент кожи. В связи с этим поставлены задачи оценить пролиферативную и метаболическую активность эмбриональных фибробластов крысы в различных условиях культивирования на раневом коллаген-хитозановом покрытии «Коллахит-бол», (патенты РФ № 2252787, № 2254145).

Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (MMCKJ, выделенных из костного мозга, является эффективным терапевтическим методом, направленным на лечение широкого спектра заболеваний, в том числе онкогематоло-гических. Для применения ММСК в клинике требуется их экспансия в культуре для наращивания необходимого количества клеток. Однако относительно свойств данного типа клеток, в том числе и таких простых для исследования, как пролиферация, по сей день не существует общего мнения. В данной работе мы изучили влияние на пролиферацию ММСК, определяемую по экспресии рецептора трансферрина CCD71J от третьего до седьмого пассажа после криоконсервации, наиболее часто применяющихся в клинике, таких факторов, как пол и возраст доноров клеток, а также количество CD71+ клеток в костном мозге, из которого были выделены ММСК. Мы обнаружили, что про-лиферативная активность ММСК не имеет выраженной зависимости от указанных факторов, а чистые популяции ММСК возможно получать от доноров в возрасте от 18 до 70 лет.

24-26 апреля в Пекине состоялась 2-я ежегодная конференция Международной ассоциации по нейрореконструкции [International Association of Neurarestoratology Annual Conference; IANRAC]. В работе конференции приняли участие представители почти 30 стран, включая Китай, США, Великобританию, Израиль, Канаду, Россию, Германию, Бразилию, Аргентину, Испанию, Португалию, Иорданию, Чехию, Польшу, Италию, Францию, Корею, Малайзию, Сингапур, Тунис и др. Российскую делегацию представляли сотрудники Института Клинической иммунологии СО РАМН и НИИ Травматологии и ортопедии Росмедтехнологий [г. Новосибирск] проф. Е.Р. Черных, к.м.н. Е.Я. Шевела и к.м.н. М.Ю. Сизиков. Основное внимание участников конференции было сосредоточено на обсуждении возможности применения новых подходов, и в первую очередь клеточных технологий, с целью восстановлению поврежденной нервной ткани. Наряду с докладами, посвященными экспериментальному обоснованию возможностей стимуляции репаративных процессов [Geoffrey Raisman, Dajue Wang, Daqin Li, Великобритания; Wise Young, Michael Chop, Patricia E. Phelps, США; Zhicheng Zhang, Китай и др.], на конференции были представлены результаты клинических испытаний различных типов клеток в лечении травматического повреждения спинного мозга и некоторых других заболеваний нервной системы [Hongyan Huang, Lin Chen, Китай; Almudena Ramos-Cueto, Испания;