An influence of trichostatin a on neuronal differentiation of human bone marrow stromal cells

Full Text

Введение

С того времени, как было обнаружено, что стромальные клетки, или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [ММСК], изолированные из костного мозга человека, могут быть дифференцированы in vitro в нейроноподобные клетки под влиянием химических агентов и/или факторов роста, они представляются привлекательной альтернативой эмбриональным прогениторным нервным клеткам. Однако до сих пор сохраняются сомнения и даже скептицизм относительно идентичности получаемых нейроноподобных клеток нервным [1]. Во многих протоколах для индукции используются химические вещества с неизвестным механизмом действия, такие как ß-меркаптоэтанол, диметилсульфоксид, бутилированный гидроксианизол и др. [2-4]. Картина дифференцировки, морфологически очень похожей на нейрональную, возникает при воздействии этих веществ в течение первых суток. Однако такие клетки не являются жизнеспособными. Изменения клеточной морфологии все чаще связывают с повреждающим воздействием данных веществ и рассматривают их не как дифференцировку, а как артефакт [5-7]. Обработка ММСК естественными факторами роста и индукторами в другой группе исследований [8-11] не ведет к массовой морфологической дифференцировке, а получаемые нейроноподобные клетки имеют целый ряд морфологических и биохимических отличий от нервных клеток или их предшественников. Возможная степень, с которой стромальные клетки костного мозга могут быть дифференцированы в нервные, до сих пор не определена. К тому же остается неясным, все ли клеточные популяции ММСК способны к нейральной дифференцировке, так как в разных работах используются различные способы селекции и культивирования ММСК, а также приводятся разноречивые данные о доле клеток, способных превращаться в нейроноподобные (от 0,5 до 50%).

Наиболее адекватным подходом, представляющим и теоретический, и практический интерес, является использование в исследованиях нейрональной дифференцировки ММСК естественных индукторов. Одним из таких часто применяемых индукторов является РК - нативный морфоген, играющий особую роль в формировании нервной системы и в нейрональной дифференцировке. Показано, что in vitro РК усиливает дифференцировку прогениторных нервных клеток и индуцирует нейрональную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток, клеток эмбриональных карцином и нейробластом [12-15]. Обработка РК ММСК взрослого человека не оказывает дифференцировочных влияний даже в условиях сниженного содержания сыворотки. В разработанных ранее протоколах нейрогенные эффекты были получены только при совместном действии РК и набора факторов роста [8, 16]. Имеются данные о том, что действие РК и других ядерных гормонов может модулироваться веществами из группы ингибиторов гистоновых деацетилаз, изменяющими хроматин путем ацетилирования гистонов и таким образом облегчающими доступ активаторных факторов к промоторным участкам генов [17]. На клетках Р19 эмбриональной карциномы было показано, что ТСА, являющийся специфическим ингибитором гистоновых деацетилаз, значительно усиливает нейрогенные эффекты РК путем активации транскрипции от PK-зависимых промоторов [14]. Основываясь на этих данных, мы предположили возможность потенциирования ТСА действия РК на ММСК человека.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК человека

ММСК получены из 5 мл аспирата костного мозга четырех добровольных доноров. С помощью центрифугирования аспирата в градиенте плотности Histopaque-1077 [Sigma, США] в течение 30 мин при 1000 g выделяли фракцию мононуклеарных клеток. Клеточную суспензию промывали однократно в растворе Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ [Gibco, США]. Выделенные клетки культивировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы [Биолот, Россия] с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы SC-Biol [Биолот, Россия] и 50 мкг/мл гентамицина сульфата [Gibco, США] в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С и 5% концентрации СO₂. Через 48 часов культивирования среду с неприкрепившимися клетками полностью заменяли на свежую. В дальнейшем половину среды меняли каждые 4-5 сут. После образования клеточного монослоя клетки снимали с культуральных чашек путем инкубации с раствором 0,25% трипсина и 1 тМ ЭДТА [Gibco, США] при температуре 37°С в течение 2-3 мин и пересевали на новые чашки в концентрации 10⁵ кл./см².

Индукция направленной дифференцировки ММСК

Индукцию направленной нейральной дифференцировки начинали не ранее пятого пассажа, высевали в 35 мм чашки Петри с покровными стеклами, покрытыми поли-L- лизином [Sigma, США]. Посевная концентрация составляла 5х10³ кл./см². После 24 ч начинали обработку клеток индукторами согласно трем протоколам.

I протокол: 0,5-10 мкМ РК [Sigma, США] добавляли одновременно с заменой половины среды на свежую каждые 5 сут.

II протокол: 150 нг/мл ТСА [Sigma, США] вводили в среду культивирования однократно через 24 ч после рассева клеток, а 10 мкМ РК добавляли, как в первом протоколе, каждые 5 сут.

III протокол: 100 нг/мл ТСА и 10 мкМ РК вводили одновременно с заменой половины среды на свежую каждые 5 сут.

Фазово-контрастная микроскопия

Наблюдения за изменением морфологии клеток проводили с помощью инвертированного светового микроскопа Nicon eclipse TS100, устанавливая фазовый режим. Клеточные культуры фотографировали на встроенную цифровую камеру, соединенную с компьютером. Для регистрации изображений использовали программу Example.

Иммунофлюоресцентный анализ

Клетки на покровных стеклах фиксировали 4% формалином [Sigma, США] в течение 7 мин. После трехкратной промывки PBS клетки пермеабилизировали 0,1% раствором Тритон Х-100в течение 7 мин. Клетки снова отмывали PBS и затем инкубировали 30 мин в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина [БСА] и 2% сыворотки эмбрионов коров [СЭК] для предотвращения неспецифического связывания антител. Затем препараты были инкубированы с первыми антителами в течение ночи при температуре 4°С. Для иммуноцитохимического выявления нейронспецифических белков были использованы кроличьи поликлональные антитела к нейрофиламенту М [NF-M] [Chemicon, США] и мышиные моноклональные антитела к белку τ-1 [Chemicon, США]. Далее препараты инкубировали со вторыми антителами при 37°С в течение 2 ч. Козьи антикроличьи IgG, конъюгированные с TRITC [Sigma, США], и кроличьи антимышиные IgG, конъюгированные с FITC [Sigma, США], были использованы как вторые антитела. После нескольких промывок PBS препараты заключали в среду Vectashield [Vector LaboPKtories, США]. Клеточные препараты изучали с помощью лазерного конфокального флюоресцентного микроскопа [Leica TCS SL], используя для визуализации метки два отдельных канала.

Результаты

Морфологическая характеристика и пролиферативный потенциал ММСК взрослого человека in vitro

ММСК взрослого человека культивировали в течение длительного времени [более трех месяцев]. На первых пассажах культура ММСК была представлена, главным образом, вытянутыми фибробластоподобными клетками, формирующими розетки [колонии] [рис. 1а]. Через три недели культивирования ММСК приобретали более распластанную форму и обнаруживали выраженную морфологическую гетерогенность. Крупные фибробластоподобные клетки различались по размеру и форме и были представлены вытянутыми веретеновидными, треугольными, прямоугольными и неправильной формы клетками с небольшими отростками [рис. 16, в]. Кроме того, в культуре присутствовали редкие [~ 0,05%] мелкие клетки с нейрональной морфологией, имеющие компактное клеточное тело и отростки разной длины и степени арборизации. Характерной особенностью поздней [более 3 недель] культуры ММСК служило появление гранул на поверхности крупных клеток, что выглядело как зернистость клеток. При длительном беспассажном культивировании более четырех суток гранулы формировали крупные конгломераты и со временем отрывались от поверхности клеток [рис. 1в].

 

Рис. 1. Первичная культура ММСК взрослого человека: А — веретеновидные клетки в 10-дневной культуре; Б — крупные распластанные клетки третьего пассажа, 1 мес. культивирования; стрелками показаны мелкие клетки с нейрональной морфологией; В — крупные распластанные и удлиненные фибробластоподобные клетки седьмого пассажа, культивирование на поли-L-лизине в течение 10 сут.; стрелками показаны экскретируемые на поверхности клеток гранулы. Фазовый контраст. х20

 

ММСК обладают слабой пролиферативной активностью. В течение первых трех недель культивирования время удвоения, определяемое путем подсчета клеток при пересевах, составляло около 48 часов. При длительном культивировании уровень пролиферации постепенно снижался. Нам удалось нарастить из 5 мл аспирата костного мозга 4 млн ММСК за три недели и более 10 млн клеток - за полтора месяца культивирования.

Индукция нейронального фенотипа ММСК in vitro

1. Морфологические изменения ММСК

При обработке ММСК РК в концентрациях от 0,5 до 10 мкМ [I протокол) клетки сохраняли свою морфологию, продолжали активно делиться и экскретировать гранулы на своей поверхности. Отличительной особенностью культур, обработанных РК, по сравнению с контрольными культурами было появление через две недели культивирования более сложных форм клеток, подобных нейроглиальным (рис. 2).

 

Рис. 2. Клетки с нейрональной и глиальной морфологией в культуре ММСК, подвергнутой обработке 10 мкМ РК в течение двух недель: А — пирамидоподобная и биполярная (показана стрелкой) клетки; Б — нервная клетка с длинным отростком; стрелкой обозначено тело клетки; В, Г — глиеподобные клетки. Фазовый контраст. х40

 

При совместной обработке культуры РК и ТСА (II и III протоколы) клеточная пролиферация блокировалась введением ТСА, а на 12-е сут. индукции начинались процессы выраженных морфологических изменений. Обнаружено, что, с одной стороны, формирование в фибробластоподобных стромальных клетках оптически плотных тяжей и компактизации клеточных тел за счет ретрактильных процессов, а, с другой стороны, истончение и даже распад на фрагменты оптически светлых участков клеточного тела (рис. За). В результате около половины клеток приобрели компактную форму с маленькими клеточными телами (перикарионом) и маловетвящимися отростками (рис. 3б). Количество клеток с измененной морфологией постепенно увеличивалось при однократном введении в культуру ТСА (II протокол). Когда ТСА вводили в культуру регулярно (III протокол), доля таких клеток росла прогрессивно.

Некоторые отростки измененных стромальных клеток имели на своих концах расширения, подобные конусам роста (рис. Зв), но мы не обнаружили выраженного роста отростков в культуре. Окончания отростков образовывали концевые [по типу классических нервных) и прилегающие протяженные контакты на телах и отростках соседних клеток (см. рис. 3б, в). Отростки крайне редко пересекали друг друга, и картина межклеточных отношений напоминала реакцию контактного торможения роста отростков, часто наблюдаемую в культурах нервных клеток.

Через три недели обработки ММСК РК и ТСА в культурах появились более зрелые формы нейроноподобных клеток с ветвящимися отростками и/или компактными клеточными телами (рис. Зг, д). Их доля составила около 0,5%.

 

Рис. 3. Морфологические изменения ММСК при комбинированной обработке культур РК и ТСА: А — культура МСК на 12-е сут. индукции; угловой стрелкой показан истончающийся участок тела стромальной клетки; прямая стрелка указывает на мелкую клетку с нейрональной морфологией. х20; Б — сеть из отростчатых клеток с нейроноподобной морфологией на 14-е сут. индукции. х10; В — нейроноподобные клетки на 18-е сут. индукции; стрелка указывает на конусовидное расширение отростка. х20; Г, Д — нейроноподобные клетки на 22-е сут. индукции; стрелками показаны компактные тела мелких клеток. х20

 

Помимо морфологических изменений, наблюдаемых при совместном действии РК и ТСА на культуру стромальных клеток, мы обнаружили также исчезновение секреторных гранул на их поверхности. ММСК относятся к фибробластоподобным клеткам, основной функцией которых является обогащение межклеточного пространства матриксными белками. Под действием примененных индукторов происходят не только морфологические превращения, но и изменения в синтезе некоторых белков, по-видимому, относящихся к белкам внеклеточного матрикса. Такие изменения в белковом синтезе могут быть связаны с переориентацией клеточной функции.

Наблюдаемые нами изменения морфологии и поведения клеток под воздействием РК и ТСА - компактизация клеточных тел и отростков, визуальное увеличение их оптической плотности, образование межклеточных контактов и сети из отростчатых клеток - напоминают процессы, происходящие в культуре нервных клеток беспозвоночных и позвоночных, поэтому мы провели иммунофлюоресцентное окрашивание клеток на белки, специфичные для нейронов.

2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии и локализации нейронспецифических белков

Иммунофлюоресцентное окрашивание было выполнено на клетках, обработанных РК и ТСА в течение трех недель, а также на клетках контрольных культур. Некоторое присутствие специфичных для нервных клеток белков - NF-М и маркера более зрелых нейронов Т-1 - было обнаружено в необработанных клетках контрольных культур (рис. 4а, б). В общей массе обработанных клеток экспрессия исследуемых белков несколько увеличивалась. Причем, если для NF-М было обнаружено усиление интенсивности окраски в нейроноподобных клетках без изменения внутриклеточной локализации белка [диффузно в цитоплазме) (рис. 4в, д), то для Т-1 характерным было не только накопление в нейроноподобных клетках, но и появление в субмембранном слое многих фибробластоподобных клеток (рис. 4г, е). Заметное усиление окраски обоих белков было видно в длинных отростках и маленьких клеточных телах нейроноподобных клеток. Популяция мелких клеток с морфологией нейронов показывала особо яркое свечение, указывая на повышенный синтез в них данных белков. Двойное иммунофлюоресцентное окрашивание показало, что в таких клетках иммунореактивность к Т-1 встречалась реже, чем kNF-M.

 

Рис. 4. Экспрессия МР-М [А, В, Д] и Т-1 [Б, Г, Е] в контрольных и индуцированных культурах ММСК: А, Б — 22 сут. культивирования на поли-L-лизине [контроль): В-Е — 22 сут. индукции; стрелки указывают на тела и отростки нейроноподобных клеток.

 

Интересно отметить, что значительное усиление синтеза белков было обнаружено также в некоторых фибробластоподобных клетках (рис. 5). Таким образом, совместное действие РК и ТСА могло усиливать экспрессию нейронспецифических белков, но это не всегда сопровождалось морфологическими превращениями фибробластоподобных клеток в нейроноподобные.

 

Рис. 5. Повышенная экспрессия и абберантная локализация τ-1 в некоторых фибробластоподобных стромальных клетках, 22е сут. индукции: А — локализация τ-1 в субмембранном слое стромальной клетки [показано стрелкой). х10; Б — линейная организация τ-1 в цитоплазме стромальной клетки. Х30

 

Обсуждение

Наблюдение за ММСК при их длительном культивировании показало морфологическую неоднородность поздней популяции фибробластоподобных стромальных клеток. Если на первых пассажах клетки морфологически мало различаются и имеют вытянутую форму, то через три недели культивирования после достижения высокой плотности клеток в культуре наблюдаются выраженные изменения клеточной морфологии, и, несмотря на повторяемость многих клеточных форм, основная масса крупных стромальных клеток обнаруживает выраженную морфологическую гетерогенность. Можно выделить, как это делается в ряде работ [18, 19], два типа клеток - крупные сильно распластанные и удлиненные фибробластоподобные клетки. Все клеточные формы способны экскретировать на поверхность гранулы, что может свидетельствовать об их фибробластоподобной природе. Кроме того, во всех поздних культурах [после 2-3 пассажа] уже присутствуют редкие мелкие клетки с нейрональной морфологией.

Регулярное введение в культуру ММСК РК [I протокол] не привело к каким-либо значимым нейрогенным эффектам, в отличие от совместной обработки культур РК и ТСА. Морфологический анализ культур, индуцированных РК и ТСА, показал наличие в них двух четко выраженных популяций нейроноподобных клеток. Первая популяция - это более многочисленные [50-70%] крупные отростчатые клетки, образующиеся за счет ретрактильных процессов из больших фибробластоподобных клеток. Их разнообразие происходит, очевидно, из морфологической гетерогенности стромальных клеток. Измененные клетки напоминают нативные нервные клетки in vitro по одним морфологическим признакам [наличие длинных отростков, компактное клеточное тело] и отличаются по другим [повышенная адгезия и, как результат, отсутствие отростков кабельного типа и объемного клеточного тела; отсутствие конусов роста, выраженного роста отростков и их арборизации]. Обнаруженные изменения в экспрессии нейронспецифических белков NF-M и т-1, а также прекращение синтеза прежних белков [исчезновение секреторных гранул] свидетельствуют о том, что в таких клетках запускаются процессы нейрональной дифференцировки.

Морфологические и фенотипические превращения стромальных фибробластоподобных клеток при совместном воздействии на них РК и ТСА и по срокам, и по морфологической картине напоминают изменения, наблюдаемые в протоколах с использованием «коктейлей» из ростовых факторов [эпидермального фактора роста, основного фактора роста фибробластов, тромбоцитарного фактора роста и др.] отдельно или в комбинации с РК [8-11, 16]. Однако доля нейроноподобных клеток, получаемых в таких протоколах, невелика. Наилучшие результаты удалось получить при индукции ММСК человека эпидермальным фактором роста, основным фактором роста фибробластов и тромбоцитарным фактором роста, при культивировании клеток на фибронектине в бессывороточной среде [11]. В этом случае около 90% клеток приобретали морфологию, напоминающую строение нервных клеток, и экспрессировали повышенный уровень нейрональных маркеров. Наш протокол отличает также высокий процент выхода нейроноподобных клеток [50-70%]. При этом мы использовали для индукции ММСК взрослого человека РК без каких-либо ростовых факторов и не снижали содержание сыворотки в индукционной среде. Кроме того, обрабатываемые клетки были культивированы либо на пластике, либо на поли-L-лизине - неспецифическом субстрате, чтобы исключить дифференцировочные влияния подложки. Выраженный дифференцировочный эффект связан, по нашему мнению, с потенцированием ТСА действия РК.

Специфический ингибитор гистоновых деацетилаз ТСА усиливает ацетилирование гистонов во многих клеточных типах, включая клетки костного мозга [20]. Результатом такого ацетилирования в клетках Р19 эмбриональной карциномы является изменение локальной структуры хроматина, способствующее связыванию ядерных ретиноидных рецепторов с активаторным фактором [14]. Полагают, что с этим связано усиление нейрогенных эффектов РК при совместном использовании с ТСА на клетках Р19. Обнаруженный нами дифференцировочный эффект комбинированной обработки ММСК РК и ТСА связан, возможно, с этим механизмом. Представленные в данной работе протоколы с использованием двух индукторов РК и ТСА различались только по степени выраженности запускаемых процессов. При однократном введении ТСА в культуру [II протокол] морфологические и фенотипические изменения стромальных клеток начинались [как и в III протоколе] на 12-е сут. индукции, когда в среде уже не оставалось ТСА. Этот факт, наряду с наличием длительного латентного периода индукции, подтверждает выводы о том, что совместное воздействие ТСА и РК на клетки вызывает запуск дифференцировочных процессов. Наблюдаемые морфологические и фенотипические эффекты могут отражать дифференцировочный потенциал собственной РК. Механизмы длительного латентного периода индукции дифференцировки, наблюдаемого и в других протоколах с применением нативных индукторов, остаются невыясненными.

Необходимо отметить, что ни в одном исследовании с использованием естественных индукторов, так же, как и в данной работе, запущенные процессы дифференцировки не приводили к превращению стромальных клеток в предшественники нейронов или дифференцированные формы. Клетки приобретали ряд морфологических и фенотипических признаков, свойственных нативным нервным клеткам, но абсолютной идентичности достигнуто не было. Кроме некоторых очевидных отличий в морфологии была обнаружена также аберрантная внутриклеточная локализация некоторых нейронспецифических белков [10]. В то же время, мы обнаружили случаи повышенного синтеза и изменения внутриклеточной локализации нейрональных маркерных белков в стромальных клетках, не подвергшихся морфологической трансформации. Очевидно, что переориентация белкового синтеза определяет морфологические превращения, но изменения клеточной формы, как и перестройка внутриклеточной организации, являются, по всей видимости, более длительными процессами.

Вторая популяция нейроноподобных клеток была представлена редкими [не более 0,1%) мелкими клетками, которые имеют больше аналогий с нервными по перечисленным морфологическим признакам. Кроме того, эти клетки обнаруживают значительно более высокую экспрессию нейрон- специфичных белков по сравнению с первой популяцией крупных нейроноподобных клеток. В ряде работ по индукции нейрональной дифференцировки ММСК рассматриваются именно такие клетки [9]. Однако они происходят из отдельной малочисленной популяции плюрипотентных стволовых клеток, присутствующей как в костном мозге, так и в других тканях взрослого организма [21]. Использование этих клеток для целей клеточной терапии сегодня не представляется возможным.

Первая, более многочисленная, популяция стромальных фибробластоподобных клеток, показывающая способность к нейроноподобной дифференцировке, может рассматриваться как возможный источник клеточного материала для заместительной терапии при лечении различных неврологических заболеваний. Если удастся сделать дифференцировочные эффекты стабильными, то возможность направленной индукции фенотипических превращений, особенно таких, как экспрессия нейротрофических факторов или нейротрансмиттеров, расширила бы перспективы использования ММСК как носителей трофических и медиаторных влияний.

About the authors

I. A. Chistyakova

Institute of Cytology PAS

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

I. V. Galanin

V.M. Bechterev Psychonevrology Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

K. P. Gaydaenko

Human brain institute PAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

T. A. Skoromets

V.M. Bechterev Psychonevrology Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

A. F. Gurchin

Human brain institute PAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

G. P. Pinaev

Institute of Cytology PAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint-Petersburg

References

Supplementary files