On a way to decoding codes embryonic stem cells

Abstract

In the review the original author’s analysis of the collected information on factors of regulation pluripotency of embryonic stem cells is submitted.

Full Text

После завершения программы «Геном человека», открытия регуляторной ДНК и цис-регуляторного кода на повестку дня вышел вопрос вопросов: каким образом регуляторная информация [«углеродные мегабайты») управляет «молекулярными машинами» и внутриклеточными механизмами соматических клеток? В соматических «клетках- автоматах» сигнальные регуляторные системы определяют: 1) химический гомеостазис; 2) объемы и амплитуды физиологической функции. В отличие от большинства клеток взрослого организма, эмбриональные стволовые клетки [ЭСК] предоставляют в руки экспериментатора живой «микропроцессор», серийный множитель soft-программ в виде клона клеток. ЭСК по затратам энергии сопоставимы с клетками головного мозга и кишечника. Однако 90% всех белков ЭСК - это компоненты регуляторных сетей. 90% всей РНК в ЭСК - это мРНК регуляторных генов, иРНК - первичные триггеры раннего эмбриогенеза и селекторы соматических линий, РНК - регуляторы хроматина, компоненты молчащих - «дормантных» молекулярных структур в резервных стволовых клетках.

Где хранятся и накапливаются регуляторные мегабайты, как идентифицировать soft-материю в клетках? Электронный микроскоп не выявил принципиальных отличий в организации обычных соматических и стволовых клеток. Все стволовые клетки [СК] имеют более примитивный [минимальный] фенотип с меньшей плотностью элементов цитоскелета и органелл, отвечающих за специализацию клетки. Однако in vitro можно заставить «забыть» ЭСК свое прошлое и место организме. Вне организма в культуре над фидером ЭСК серийно копируют гены и программы эмбриогенеза в виде инфо-сырья на будущее. Сейчас разработаны методы серийного клонирования ЭСК в простых суспензионных средах или на малоадгезивном матриксе [гидрогель или Matrigel™]. Наработка любого сырья из ЭСК опирается на два свойства - плюрипотентность и самообновление.

Что такое плюрипотентность (ПП) ЭСК на языке измерений?

Описать феномен плюрипотентности можно в виде набора обязательных свойств.

1. Характерный рост плотными эпителиоидными колониями на подложке или в виде 30-сфер над фидером.
2. Наличие около 100 генов и молекулярных маркеров, экспрессирующихся только в незрелых пролиферирующих клонах ЭСК. Эти белки-маркеры не найдены в соматических клетках плода или взрослого организма.
3. По закону антагонизма генов в развитии, в ЭСК нет белков зародышевых листков и клеток взрослых тканей. Гены ПП облигатно выключены во всех соматических клетках.
4. При введении в бластоцисту, ЭСК соучаствуют в развитии, встраиваясь в ткани зародыша; они в 100% туморогенны при введении в ткани взрослого организма; в 40-70% туморогенны при ведении в постимплантационные зародыши.
5. Экстраэмбриональные ткани индуцируют ускоренную дифференировку ЭСК в соматические линии через промежуточное образование зародышевых листков и аксиальный паттернинг.
6. В простых средах и при добавлении химических индукторов ЭСК дифференцируются в линии соматических клеток в обход зародышевых листков, не демонстрируя аксиального развития и органогенеза.

Плюрипотентные 30-сферы или 20-колонии не продуцируют собственного матрикса. Первый матрикс в сферах вырабатывают клетки примитивной висцеральной энтодермы. Кавитация запускает вторичную индукцию мезодермы и кардиомиоцитов. В настоящее время разработан арсенал матриксов, на которых ЭСК животных и человека сохраняют ПП и способность к самообновлению.

Пути расшифровки кодов ЭСК

Молекулярные биологи первыми попытались отыскать простые молекулярные «отмычки» для объяснения феномена плюрипотентности. Многие лаборатории делали замеры спектра мРНК в недифференцированных ЭСК; сравнивали полученные данные с показателями клеток, вступивших в дифференцировку. Разные схемы сопоставления профиля мРНК/белов ПП-ЭСК и клеток прогениторов-дериватов привели к идентификации 109 генов плюрипотености, которые в дальнейшем разделили на 4 подгруппы [1-3]. Установлено, что «выключение» плюрипотентности происходит в течение 17-72 часов после запуска дифференцировки. Методические трудности были связаны с тем, что только первые 20 белков ПП находились в клетках в высокой концентрации. 80% белков оказались на грани порога детекции. Увеличение численности анализируемых клеток вело к нарастанию гетерогенности РНК и белков из-за неизбежной неоднородности биоматериала. Как уже много раз бывало в молекулярной биологии, анализ списка белков из «клуба плюрипотентности» мало что подсказал относительно молекулярного кода ПП-сети. [таб. 1]. Полученные «снизу» данные не проливают свет на то, как система регуляторов работает на уровне хроматина и выходного поведения клеток.

На основании каталога генов ПП комиссия международных экспертов предложила «канонизировать» 17 поверхностных антигенов и 90 генов ПП для паспортизации выделяемых линий ЭСК [4]. Молекулярная биология сделала свое дело: предложила надежные маркеры для выделения однородных клеток.

Таблица 1. Молекулярное «досье» на 40 белков «клуба плюрипотентности»

Название белка	Функция, авторы
Oct4/Nanog	Блок преждевременного образования и экспрессии генов мезо-, энто- и эктодермы, экстраэмбриональных тканей [5]
Sox2/Tcf3	Поддержание сети плюрипотентности
Nanog	Агонист энтодермы, антагонист нейроэктодермы; в комплексе с Smadl - блок BMP-сигнализации в ЭСК [6]
Tcf3	Ядерный рецептор Wnt-beta-Cat-сигнализации в ядре [7]
Sox2	Авторегулятор экспрессии Oct4, Nanog, Utf1, FGF4 [8]
Klf2/Klf4/Klf5	Кофактор самообновления плюрипотентных ЭСК [9]
FoxD 3	Grg4/FoxD3 нейтрализуют Groucho репрессорный комплекс [10]
Zpf42 (Rex1)	Гуанин-нуклеотид-фактор для Rac GTP-азы
Utf1	Белок-репрессор хроматина [11]
CD9	Трансмембранный тетраспанин, модулятор EGF-сигнализации [12]
Tdgfl (Cripto)	Репрессор GCNF в первичной полоске, ко-активатор Ыоба1-Втаб2-сигнального каскада
Dppa2/Dppa4 DppA4/DpA2 Dppa3/DppA5	Экспрессированы в недифференцированных Maldonado-ЭСК и герминативных клетках
DppA4	Белок хроматина, защищающий ПП-ЭСК от проэктодермальной дифференцировки [13]
DppA4	Дифференцировка в эктодерму
DAB2 (disabled)	Антагонист Wnt-каскада [9]
Zfx	В кооперации с h ТЬхЗ/ТсИ контролирует самообновление ЭСК [14]
Zpf206 (mice) Znf206 (human)	Агонист-коактиватор Oct4/Nanog [15]
Tcf3	Связывается с промотером Nanog [16]
c-myc	Трансфекция c-myc, Oct4, Sox2, Klf4 ревертирует фибробласты к фенотипу ПП-ЭСК [17]
Nanog+ Fbx15(Fbxo1)	Сверхэкспрессия индуцирует образование герминативного ПП эпителия из Oct4+ Sox2+cmyc+ Klf4+ индуцированных ПП клеток [18]
LeftB (Leftyl)	Метастатические опухолевые стволовые клетки лишены Leftyl [19]
Oct4-Sox2-Klf4	Активируют LeftylB ЭСК [20]
Leftyl	Блокирует фосфорилирование Smad4 (TGFB-R) [21]
Lin28	Oct4/Nanog/Sox2 трансфекция индуцирует образование ПП-СК из фибробластов; связан с малыми регуляторными РНК в ядре [22, 23]
P19	Специфический ядерный белок из сети Oct4/Nanog
Zic3	Защита ПП-ЭСК от проэнтодермальных сигналов [24]
Gbx2	Взаимодействует с репрессорным Groucho-Tle комплексом [25]
Dnmt3B	Метилаза НЗ гистонов, cis-регуляторных повторов, энхансеров, сайленсеров, промотеров [26]

Окончание таблицы 1.

Название белка	Функция, авторы
GDF3	GDF3/Lefty1 - антагонисты BMP [27, 28]
BTF3	Транскрипционный фактор; BTF3-/- зародыши мыши погибают после имплантации
Gja1	Медиатор компактизации ЭСК агрегатов (коннексин 43) блокирует ЭМТ эпибласта
Notchl	Блок Notchl индуцирует кардиомиогенез из ЭСК; поддерживает ПП-нейральные стволовые клетки [29]
Tall	Транскрипционный фактор, клоногенный фактор
Lmo2	Транскрипционный фактор, клоногенный фактор гемопоэтических клонов
HoxA9	Активатор онко-Р1т-киназы [30]
Bmi1	Из группы PcG, контролирует самообновление нейральных и кроветворных стволовых клеток [31, 32]
BMP-4	Триггер ЭСК-васкулогенеза через BMP4-FoxF1-SHH каскад; стимулятор пролиферации ЭСК в среде без сыворотки [33, 34]
Meisl	Активатор cyclin D1 и с-тус [35]
Pax6	Поддерживает экспрессию Sox2 в нейральных стволовых клетках [36]
Otx2	Индуктор нервной пластинки
Lhx2	Cyclin D1 контроль в G1 и S-фазу через ERK [37]
Пояснения Oct4 - фактор транскрипции, обнаруженный только в СК млекопитающих. Его нет в дифференцированных соматических клетках. Oct4 не найден в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (мезенхимальных стволовых клетках) и региональных СК. Максимальное количество Oct4 выявлено в комплексе с другими белками плюрипотентности и ДНК в ядре. 50%-снижение Oct4 ведет к образованию трофобласта из ЭСК. Повышение Oct4 на 50% ведет к образованию энтодермы. В эпителиоидных линиях ЭСК прослеживается корреляция между уровнем Oct4-Nanog-Sox2 в ядре и уровнем Е-кадгерина на поверхности клеток. Зародыши-мутанты Oct4-/- в 100% случаев погибают на стадии двухслойного цилиндра. Комплекс FoxD3-Oct4 взаимодействует с промотером остеопонтина, открывает путь спецификации энтодермы. Одновременно комплекс Oct4-FoxD3 блокирует преждевременную активацию промотеров FoxA1/FoxA2 [38]. В поздней гаструле исчезающий Oct4 находится в комплексе с М1х11 (маркер первичной полоски). Все линии ПП-ЭСК отличаются рекордно высоким уровнем синтеза РНК, белков, пятикратно повышенным уровнем всех рибосомальных РНК. Полагают, что это связано с важной ролью регуляторных мРНК и иРНК. В недалеком будущем наборы регуляторных микроРНК будут использоваться для лабораторной унилинейной дифференцировки ЭСК или других СК в обход эмбриональной индукции и зародышевых листков.

Сопоставление 20-протеомных карт всех известных ЭСК по тому же принципу выявило 92 белка. Сопоставление 2D-протеомных карт незрелых ЭСК и мезенхимальных стволовых клеток [МСК] привело к идентификации 52 общих белков, соучаствующих в сети ПП [39]. Однако найти общий функциональный смысл работы этой весьма гетерогенной группы белков пока не удалось. Oct4, Nanog, Sox2 и другие белки сети ПП-ЭСК не найдены в ядре эпителиальных региональных СК и региональных МСК [40]. Напомним, что функции 40% генов, работающих в ЭСК человека и млекопитающих, ещё не установлены.

Ясно, что плюрипотентность ЭСК не сводима только к набору молекулярных маркеров или профилю выходных физиологических реакций. Скорее, плюрипотентность можно определить паттернами поведения ЭСК, которое управляется эпигенетическими сигналами. Корпоративный молекулярный подход позволяет лучше понять сетевую организацию плюрипотентности ЭСК. Центральное ядро из ключевых генов плюрипотентности окружено сетью из сигнальных белков- агонистов и сигнальных белков-антагонистов [Brachyury, Dkk1, HLX1, GATA6, ID2, Dlx5], Сигнальная сеть из белков- антагонистов с входной стороны связана с основными потоками дифференцировочных сигналов, поступающих через 4 главных пути: Wnt-, Activin/Nodal-, BMP- и FGF-каскады. Эффекторной частью сеть антагонистов связана с ядром плюрипотентных генов. Поэтому с помощью сети агонистов/ антагонистов главная программа плюрипотентности получает шкалу «тонкой настройки» [41]. Если начальные ЭСК имеют индивидуальный фенотип и профиль ключевых генов ПП, то разные клоны и регенерационные модули на базе одиночных ЭСК имеют «корпоративный» фенотип. Поэтому характеристики линий ЭСК, отдельных клеток и клеточных модулей должны существенно различаться.

Новые функциональные признаки «клуба белков плюрипотентности» приоткрылись на стыке анализа сиквенсов промоторов и взаимодействующих с ними регуляторных белков [методом иммунопреципитации на ДНК]. Оказалось, что главные белки плюрипотентности Оct4, Nanog и Sox2 в ЭСК человека связаны соответственно с промоторами 523, 1271 и 1687 генов. В мышиных ЭСК Оct4 и Nanog связаны с 1083 и 3000 генами развития соответственно [включая транскрипционные факторы] [42]. Интересно, что 353 гена развития связывали по промоторам сразу весь комплекс Oct4/Nanog/Sox2. Половина генов активируется комплексом Oct4/Nanog/Sox2, остальные остаются под стабильной репрессией. Среди активированных генов имеются кластеры Wnt- и TGFß-сигнальных каскадов. Высокий уровень белков ПП регулируется множественными петлями обратной положительной и отрицательной связи [8]. Например, незначительное повышение уровня Sox2, 0ct4 или Nanog белков индуцирует репрессию их синтеза. Изучение функций генов из «клуба плюрипотентности» с помощью техники нокаут и нокдаун позволило в первом приближении оценить вклад отдельных генов [табл. 2].

Таблица 2. Краткая характеристика некоторых генов «клуба полипотентности»

Название гена	Результат нокаута или лишней дозы
Rac1, CDC 42	Превращают эмбриобласт в эпибласт
Двойная доза гена CDC42, Rac-1	Блок ЭМТ в эпибласте, нет первичной полоски, гигантские клетки эпибласта
mESC Е- Cadherin-/-	Фрагментация эпибласта, дезорганизованная мезодерма, ранняя экспрессия генов мезодермы
Oct4 -/-	Уродства эпибласта, яйцевого цилиндра, выключение сети плюрипотентности
FoxD3-Z-	Выключение генов ПП и mRNA для Cripto, Nodal, Otx2
Sox-2 -/-	Полный блок эпибласта
в1 integrin -/-	Блок образования эпибласта за счет остановки синтеза базальной мембраны
Cdx2-/-	Нет трофэктодермы
Eomes-/-	Нет имплантации и трофэктодермы
Wnt3a-/-	Уродства гаструлы
Tcf3-/-	Эктопическая дупликация гаструлы
Lefty -/-	Множественные экто-копии ПП
Cerebrus -/-	Множественные экто-копии ПП
FGF-4-/- FGF-8-/-	Летальные аномалии гаструлы
TGFB1 -/-	Летальные аномалии гаструлы без мезодермы
BMP-4 -/ Nodal -/- Smad4 -/-	Летальные аномалии гаструлы без мезодермы
Frz-/- Wnt-11 -/- Wnt3a -/-	Блок миграции мезодермы, нет ПП, узелка, мезодермы, блок экспрессии Brachyury
Goosecoid -/-	Блок ПП
Nodal -/-	Блок ПП
Nodal, Wnt3, FGF8 FGF4, BMP - 4, Otx2	Первичные сигналы ПП
Smad 4 -/-	Дефекты образования примитивной энтодермы
Suz12 -/-	Нет НЗК27- триметилирования, преждевременная дифференцировка ЭСК
5-аза-цитидин -/-	Низкая численность клеток в эпибласте
BMP8 -/-	Уменьшена численность примордиальных половых клеток

Регуляторные РНК и плюрипотентность

В ЭСК и ранних зародышах идентифицировано 20 00040 000 иРНК, контролирующих включение и/или выключение разных групп генов раннего и позднего эмбриогенеза [43]. Часть иРНК контролирует компактную упаковку гетерохроматина [44]. Избыток регуляторных РНК, контролирующих осевой паттернинг, органогенез, коммитирование соматических линий позволяет использовать эти сигналы без остановки пролиферации клеток и «на ходу» реструктурировать хроматин в делящихся клетках. Молекулярным инструментом эмбриональной индукции, либо сигнальных «диалогов» между зародышем и экстраэмбриональными тканями служат так называемые секреторные микровезикулы, нафаршированные регуляторными мРНКи иРНК [45]. Например, супрессия 0ct4 в ЭСК с помощью селективной иРНК, индуцирует селективную экспрессию Cdx2, Handl, PL-1 и других генов трофэктодермы с образованием характерных гигантских клеток трофобласта. Направленное иРНК выключение Nanog в ЭСК индуцирует образование экстраэмбриональной энтодермы и экспрессию её ключевых генов [GATA-4, GATA-6, ламинин В1]. С помощью микровезикул, изолированных из ЭСК, кроветворные стволовые клетки удалось репрограммировать в 0ct4⁺ Nanog⁺ Rex-1⁺ плюрипотентные клетки [45].

Например, полное подавление активности мРНК гена □ct4 приводит к автоматическому запуску экспрессии гена Cdx2 и дифференцировке трофэктодермы и трофобласта из ЭСК. Пятидесятипроцентное выключение активности мРНК Oct4 в тех же клетках индуцирует образование энтодермы с экспрессией GATA-4/GATA-6/S0X-17 [46].

Плюрипотентность и хроматин

Геном человека, включающий 35 000 генов и 3,2 млрд азотистых оснований, подвергается 400 000 кратной микроупаковке, чтобы уместиться в клеточном ядре. Как упакованы 2% «смысла» среди 98% бессмысленной цепочки длиной 2 метра в клеточном ядре? [47]. Ядро обычной интерфазной соматической клетки компартментализовано на функциональные модули - ядерные поры, гетеро- и эухроматин, белковые тела, фибриллы и комплексы, петли хроматина, фабрики транскрипционных факторов, регуляторные модули супрессии и активации генов, межхромосомные комплексы. Специальные исследования под конфокальным микроскопом показали, что хроматин плюрипотентных ЭСК содержит менее компактные территории эухроматина и более диффузные области гетерохроматина [48, 49]. Одновременно все модули хроматина организованы более пластично и динамично.

Как правило, периферия ядра соматических клеток лишена эухроматина, тогда как наиболее активная часть петель хроматина локализована внутри сердцевины ядра [50]. Стабильно «дормантные» гены собраны около центромерной ДНК. Градиент эухроматина/гетерохроматина менее выражен в ядрах ЭСК за счет нарастания факультативного гетерохроматина. Конститутивный хроматин, как известно, маркируется метилированными 7-лизинами в НЗ гистонах. Метилирование ДНК и гистонов в плюрипотентных клетках передается новым поколениям клеток [эпигенетическая память]. Используя флуоресцентно меченые гистоны Н2В и НЗ, обнаружена их повышенная мобильность и обмениваемость в гетерохроматине ЭСК [51].

Хроматин стволовых клеток полностью репрессирует все гены раннего, позднего эмбриогенеза и дифференцировки всех клеточных линий. В активном состоянии находятся гены, участвующие в самообновлении плюрипотентных клеток.

Главной особенностью плюрипотентных ЭСК считают гипердинамическую [«дышащую»] организацию хроматина, основанную на рыхлых контактах гистонов и главных транскрипционных комплексов с фибриллами и матриксом [51, 52].

В самое последнее время удалось установить первые прямые молекулярные маркеры состояния хроматина в эмбриональных стволовых клетках, некоторых региональных стволовых клетках [нейральных стволовых клетках, НСК] и соматических клетках [фибробластах]. Сказалось, что карты триметилированных лизинов в гистонах существенно отличаются в ЭСК, НСК и фетальных фибробластах [53]. 90% промоторов в хроматине ЭСК маркировались триметилиро- ванным 4-лизином гистона НЗ [что характерно для неактивного хроматина дормантных локусов]. Другой вариант неактивного хроматина - это триметилированный 27-й лизин гистона НЗ. Активные зоны хроматина имеют НЗ гистон, ацетилированный по 9-му лизину и метилированный по 4-му лизину [54].

Клон ЭСК как строительный модуль

Каждый клон ЭСК представляет естественный мост между отдельной клеткой и регенерационной тканью, между индивидуальным и корпоративным фенотипом, между индивидуальным и корпоративным поведением клеток. Все эпителиальные региональные стволовые клетки делятся асимметрично. Если истинные стволовые клетки контролируют численность первого поколения прогениторов, то потомство прогениторных клеток контролирует занимаемую территорию и обновление клеток на этой территории.

Клетки приходят и уходят, но контролируемые территории остаются.

Современная геномика и протеомика позволяет очертить этот переход от плюрипотентности и самообновления к мезо-энтодерме или экстраэмбриональным тканям. Новообразованная зародышевая эмбриональная ткань оснащена набором наиболее известных лигандов/рецепторов, TGFß-, Wnt-, BMP-, FGF-сигнальными каскадами. Новые гены зародышевых листков и сигнальных каскадов автоматически выключают «ядро» из 109 генов плюрипотентности и самообновления [55-57]. Эмпирически было найдено, что тандем Gct4-Sox2 кооперативно активирует экспрессию FGF4 и UTF1 [58]. Тандем белков Gct4/FoxD3 связывается и активирует промотер остеопонтина и одновременно блокирует экспрессию генов энтодермы FoxA1/ FoxA2 [38]. LIF/Stat3 сигнальный каскад и синхронная экспрессия CD9 рецептора-тетраспанина облигатно связаны с плюрипотентностью/самообновлением ЭСК мыши; в ЭСК человека эта связь не установлена [58, 59]. Это объясняется тем, что LIF/Stat3 каскад активирует высокий тус в цитоплазме ЭСК именно мыши [60].

Антагонизм в экспрессии Gct4 и Cdx2 регулирует пропорцию ЭСК и трофэктодермы в культуре [61, 62]. Высокий уровень Gct4/Sox2/Nanog белков в хроматине линейно коррелирует с уровнем Е-кадгерина в плазматической мембране и эпителиальным статусом ЭСК [2].

Избирательное выключение Gct4 с помощью иРНК приводит к изменению экспрессии более 1000 генов в ЭСК человека [41]. Активируется экспрессия Cdx2/Eomes, хотя появление клетоктрофобласта не было верифицировано под микроскопом. Одновременное подавление экспрессии Nanog, Sox2, Rex1, LeftA, LeftB, DPPA4, Zic3, Thy1, TDGF1, PRDM14 сочеталось с активацией экспрессии генов мезоэндодермы [Brahyury, Tbx18, ВМР4, Wnt, FGF/FGFR, activin, Notch, GATA-4, GATA6, Dkk, Id2, HLX1], Половина генов из группы репрессированных ИРНК анти- Оct4 были гены из «клуба плюрипотентности», связанные премоторной сетью с Nanog, Sox2, Rex1 и т.д. Селективное выключение Оct4 с помощью ИРНК вызывало сильную активацию экспрессии/ синтеза лизин-метилтрансферазы [НЗ-К4-НТТase] гистонов, а также ацетилазы H2AFY/H2AFY2, деацетилазы HDAC6. Между тем экспрессия гистон-лизил-метил-трансферазы H3-K27-HMT-ase практически полностью подавлялась.

В модуле или клоне ЭСК работает закон антагонизма ведущих программ развития. Например, программа поддержания плюрипотентности исключает одновременный запуск дифференцировки, факторов транскрипции гаструлы и зародышевых листков. Закон антагонизма программ развития имеет огромное значение для понимания организации работы хроматина в ЭСК. Высокая экспрессия Gct4-Nanog- FoxDS не только стабилизирует от помех модуль генов, ответственных за самообновление ЭСК. Одновременно эта сигнальная сеть мозаично снижает чувствительность клеток к индукторам дифференцировки [63]. Например, транскрипционный фактор Zic3 не только корпоративно держит «планку плюрипотентности», но и одновременно направленно поддерживает экспрессию Nanog на высоком уровне. Селективная иРНК против Zic3, избирательно снижая уровень Nanog в клетках, направленно смещает дифференцировку в сторону энтодермы.

В развитии работает закон клеточных сигнальных корпораций, которые с помощью синергизма/антагонизма программ намечают баланс территорий, предназначенных для разных путей развития.