BACKGROUND: The epidermal growth factor receptor (EGFR) is one of the key proteins in cell signaling that regulates mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. EGFR dysregulation is associated with various neoplasms, highlighting the importance of developing targeted EGFR inhibitors. Binase, a ribonuclease (RNase) from Bacillus pumilus, is a promising antitumor agent capable of interacting with EGFR. Its cytotoxic potential is primarily determined by its activity against intracellular RNA. Binase mutants with reduced catalytic activity, K26A and H101E, also demonstrate antitumor properties.
AIM: This study aimed to assess the effect of interactions between binase mutants and EGFR on their cytotoxic potential.
METHODS: The antiproliferative activity of binase and its mutants K26A and H101E, with residual catalytic activity of 11.0% and 0.02%, respectively, was evaluated using the MTT assay in A431 epidermoid carcinoma cells, which overexpress wild-type EGFR. Immunofluorescence analysis was used to examine the interactions of RNases with EGFR and their ability to modulate the MAPK/ERK pathway. Hypothetical protein–protein interaction models were generated using computational modeling. The antimigratory activity of RNases was assessed using the standard scratch assay.
RESULTS: Binase and its mutants reduced the proliferative activity of A431 tumor cells by 40%. Pretreatment of cells with the monoclonal anti-EGFR antibody cetuximab attenuated the cytotoxic potential of binase mutants. Computational modeling indicated that the tested RNases may interact with EGFR, with binase having a higher affinity for the ATP-binding site of the tyrosine kinase domain and the mutant derivatives binding preferentially to regions involved in receptor endocytosis. This may underlie the observed differences in EGFR internalization rates. Unlike binase and the K26A mutant, the catalytically inactive H101E mutant lacks antimigratory activity, indicating the importance of maintaining a certain level of enzymatic activity.
CONCLUSION: EGFR is a target of the cytotoxic activity of binase mutants, and their interaction inhibits the MAPK/ERK signaling pathway and causes tumor cell death.
Обоснование. Рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) — один из ключевых белков клеточного сигналинга, контролирующего каскады митоген-активируемых протеинкиназ (mitogen-activated protein kinase, МАРК). Нарушение функционирования EGFR ассоциировано с развитием различных опухолевых заболеваний, что указывает на актуальность разработки таргетных анти-EGFR-препаратов. Одним из перспективных противоопухолевых агентов, способных взаимодействовать с EGFR, является рибонуклеаза (РНКаза) Bacillus pumilus — биназа, цитотоксический потенциал которой в первую очередь обусловлен её активностью в отношении внутриклеточной РНК. При этом мутантные формы биназы K26A и H101E со сниженной каталитической активностью также обладают противоопухолевыми свойствами.
Цель. Оценить вклад взаимодействия мутантных форм биназы с EGFR в их цитотоксический потенциал.
Методы. Характеристику антипролиферативной активности биназы и её мутантных форм — K26A и H101E с остаточной каталитической активностью в размере 11,0 и 0,02% соответственно — проводили методом МТТ-теста на линии клеток эпидермоидной карциномы А431 с повышенным уровнем экспрессии EGFR дикого типа. Взаимодействие РНКаз с EGFR и их способность модулировать МАРК/ERK-каскад исследовали с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Гипотетические модели белок-белкового взаимодействия конструировали с использованием средств компьютерного моделирования. Антимиграционную активность РНКаз оценивали в стандартном тесте на зарастание царапины.
Результаты. Установлено, что биназа и её мутанты снижают пролиферативную активность опухолевых клеток А431 на 40%. Предварительная обработка клеток моноклональным антителом к EGFR цетуксимабом приводит к ослаблению цитотоксического потенциала мутантов биназы. С помощью средств компьютерного моделирования показано, что исследуемые РНКазы способны взаимодействовать с EGFR, при этом предсказано, что биназа обладает большей аффинностью к АТФ-связывающему сайту тирозинкиназного домена, а мутантные производные — к области, отвечающей за эндоцитоз рецептора. Это может опосредовать наблюдаемые различия в скорости интернализации EGFR. В отличие от биназы и мутанта K26A, каталитически неактивный мутант H101E не обладает антимиграционной активностью, что указывает на важность наличия определённого уровня ферментативной активности.
Заключение. EGFR является мишенью цитотоксического действия мутантных форм биназы, взаимодействие с ним приводит к ингибированию сигнального пути МАРК/ERK и гибели опухолевых клеток.