Genes & CellsGenes & CellsГены и КлеткиGenes and Cells2313-18292500-2562Human Stem Cells Institute65584610.17816/gc655846USBLTLOriginal Study ArticlesОригинальные исследованияResearch ArticleCollagen-based conjunctival tissue equivalent: in vitro evaluation of biocompatibility and biomechanical propertiesЭквивалент конъюнктивальной ткани на основе коллагена: исследование биосовместимости и биомеханических свойств in vitrohttps://orcid.org/0000-0001-6974-78724861-4771KrivolapovaDiana A.КриволаповаДиана Алексеевна
Russian Federation
dia.med94@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0267-90406410-7993AndreevAndrey Yu.АндреевАндрей Юрьевич
Russian Federation

MD, Cand. Sci. (Medicine)

канд. мед. наук

docandreev@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8258-60113898-2570SubbotAnastasia M.СубботАнастасия Михайловна
Russian Federation

MD, Cand. Sci. (Medicine)

канд. мед. наук

kletkagb@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-7115-42759784-0459AvetisovSergey E.АветисовСергей Эдуардович
Russian Federation

МD, Dr. Sci. (Medicine), Professor, Aacademician of the Russian Academy of Sciences

д-р мед. наук, профессор, академик РАН

s.avetisov@niigb.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2549-40119995-3951OsidakEgor O.ОсидакЕгор Олегович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biology)

канд. биол. наук

eosidak@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0009-7926-7253IlinaPolina N.ИльинаПолина Николаевна
Russian Federation
polinailina1107@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9322-6273PanovaAnna D.ПановаАнна Дмитриевна
Russian Federation
ainushgnomello@gmail.comM.M. Krasnov Research Institute of Eye DiseasesНаучно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. КрасноваImtek Ltd.ООО Фирма «Имтек»The First Sechenov Moscow State Medical UniversityПервый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and ImmunologyНациональный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева24062025230720252021301401902202505052025Copyright ©; 2025, Eco-VectorCopyright ©; 2025, Эко-Вектор2025Eco-VectorЭко-Векторhttps://genescells.ru/2313-1829/article/view/655846

BACKGROUND: The development of a conjunctival equivalent capable of repairing tissue defects and preventing pathological scarring is a critical goal in biomaterial design for reconstructive procedures, in which collagen is frequently employed. Evaluating the biocompatibility and biomechanical properties of such materials supports the advancement of effective surgical approaches for conjunctival reconstruction.

AIM: The work aimed to evaluate the biocompatibility of human conjunctival epithelial cells (hCECs) with a collagen membrane (CM) developed using an original technique in vitro; to confirm its noncytotoxicity toward hCECs; to characterize hCEC morphology and expression of specific proteins on CM; and to compare the biomechanical properties of CM with native conjunctiva.

METHODS: A primary culture of hCECs was obtained using the explant method and verified through staining for the markers cytokeratin 7 and mucin 5AC. Two CM formulations (collagen concentration 10 mg/mL and 30 mg/mL) were tested. Cytotoxicity of the 30 mg/mL CM was evaluated by seeding hCECs at 50,000 cells/cm2 followed by MTS assay and viability testing with calcein-AM and Hoechst staining. hCECs morphology was analyzed using phase-contrast images of the cell culture after seeding on CM and immunocytochemical staining for cytokeratin 7 and mucin 5AC. Biomechanical properties of the 30 mg/mL CM and conjunctiva were assessed using static and dynamic tests on an indentation machine.

RESULTS: Phase-contrast microscopy revealed that within 1 week after seeding, hCECs migrated into the inner layers of the 10 mg/mL CM, whereas on the 30 mg/mL CM, the cells formed a confluent monolayer on its surface. The metabolic activity assay revealed no significant difference between the control groups and 30 mg/mL CM. In the live/dead assay, 95% of cells in both groups stained positive with calcein. The immunocytochemical profile of hCECs remained unchanged: as in the control group, cells cultured on the CM expressed conjunctiva-specific cytokeratin 7 and mucin 5AC. The Young’s modulus values for the CM and bulbar conjunctiva were comparable: 0.0008739 ± 0.0004332 GPa and 0.0009472 ± 0.001323 GPa, respectively (p = 0.0549). The hardness of the CM was significantly higher than that of the conjunctiva (p < 0.0001), while its viscosity was significantly lower compared to native tissue (p < 0.0001).

CONCLUSION: hCECs remained viable after seeding on the tested CM, confirming its noncytotoxicity. The migration of hCECs into the matrix indicates the material’s ability to create a favorable microenvironment for conjunctival epithelialization and to undergo resorption following cell colonization. Preservation of the molecular profile of hCECs indicates high biocompatibility of the CM with conjunctival epithelium. The 30 mg/mL CM exhibits elasticity comparable to that of conjunctiva, with higher hardness and lower viscosity. Optimization of CM biomechanical properties for specific clinical needs holds promise.

Обоснование. Создание эквивалента конъюнктивы, способного замещать дефекты ткани и предотвращать патологическое рубцевание, — ключевая задача разработки биоматериалов, для изготовления которых часто используется коллаген, в реконструктивных вмешательствах. Оценка биосовместимости и биомеханических свойств таких биоматериалов способствует развитию перспективных хирургических методик устранения дефектов конъюнктивы.

Цель. Оценить биосовместимость эпителиальных клеток конъюнктивы (ЭКК) человека и коллагеновой мембраны (КМ) оригинальной технологии in vitro; отсутствие её цитотоксичности для ЭКК; морфологию и паттерн характерных белков ЭКК на КМ; охарактеризовать биомеханические свойства КМ в сравнении с нативной конъюнктивой.

Методы. Первичная культура ЭКК получена эксплантным методом и верифицирована путём окрашивания на маркёры цитокератин 7 и муцин 5АC. Исследовали КМ с концентрацией коллагена 10 и 30 мг/мл. Цитотоксичность КМ 30 мг/мл оценивали при высеивании ЭКК в плотности 50 тыс./см2, проведя MTS-тест и оценку на выживаемость путём окраски кальцеином АМ и Hoechst. Морфологию ЭКК оценивали по фазовоконтрастным снимкам культуры клеток после посева на КМ и иммуноцитохимического окрашивания на цитокератин 7 и муцин 5АC. Биомеханические показатели КМ 30 мг/мл и конъюнктивы исследованы статическими и динамическими тестами на машине-инденторе.

Результаты. По результатам фазовоконтрастной микроскопии, в течение недели после посева на КМ 10 мг/мл отмечена миграция ЭКК во внутренние слои носителя, на КМ 30 мг/мл выявлен рост сливным монослоем по поверхности мембраны. Тест на метаболическую активность не установил значимого различия между группами контроля и КМ 30 мг/мл. В тесте live/dead и в группе контроля, и в группе КМ 95% клеток были положительно окрашены кальцеином. Иммуноцитохимический профиль ЭКК не изменялся: как и в группе контроля, на КМ клетки экспрессировали характерные для конъюнктивы цитокератин 7 и муцин 5АC. Показатели модуля Юнга КМ и бульбарной конъюнктивы оказались сопоставимыми: 0,0008739±0,0004332 и 0,0009472±0,001323 ГПа соответственно (p=0,0549). Показатель твёрдости КМ оказался выше конъюнктивы (p <0,0001), а показатель вязкости — ниже показателей нативной ткани (p <0,0001).

Заключение. ЭКК сохраняли жизнеспособность после посева на исследованные КМ, подтверждая отсутствие её цитотоксичности. Миграция ЭКК вглубь матрикса свидетельствует о способности материала создавать благоприятную микросреду для эпителизации конъюнктивы и резорбироваться после заселения клетками. Сохранение молекулярного паттерна ЭКК свидетельствует о высокой биосовместимости КМ с клетками конъюнктивального эпителия. КМ 30 мг/мл обладают упругостью, аналогичной конъюнктиве; имеют бóльшую жёсткость и меньшую вязкость. Перспективна оптимизация биомеханических свойств КМ под конкретные клинические задачи.

conjunctivaconjunctival reconstructiontissue engineeringconjunctival epitheliumcollagenbiopolymersindentationконъюнктивареконструкция конъюнктивытканевая инженерияэпителий конъюнктивыколлагенбиополимерыиндентированиеThis study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (No. 24-15-00387, https://rscf.ru/project/24-15-00387/). Viscoll preparations with collagen concentrations of 10 or 30 mg/mL, used for the fabrication of collagen membranes, were provided by Imtek LLC (Moscow, Russia).Исследование поддержано грантом Российского научного фонда (№24-15-00387, https://rscf.ru/project/24-15-00387/). Препараты Viscoll с концентрацией коллагена 10 или 30 мг/мл для изготовления коллагеновых мембран предоставлены компанией ООО Фирмы «Имтек».Nelson JD, Cameron JD. The conjunctiva: anatomy and physiology. Cornea. 2005;1:39–54.Downie LE, Bandlitz S, Bergmanson JPG, et al. CLEAR — Anatomy and physiology of the anterior eye. Cont Lens Anterior Eye. 2021;44(2):132–156. doi: 10.1016/j.clae.2021.02.009 EDN: DZTEPQGipson IK. Distribution of mucins at the ocular surface. Exp Eye Res. 2004;78(3):379–388. doi: 10.1016/s0014-4835(03)00204-5Stewart RM, Sheridan CM, Hiscott PS, et al. Human conjunctival stem cells are predominantly located in the medial canthal and inferior forniceal areas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(3):2021–2030. doi: 10.1167/iovs.14-16266Hatton MP, Rubin PA. Conjunctival regeneration. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005;94:125–140. doi: 10.1007/b100002Di Pascuale MA, Espana EM, Liu DT, et al. Correlation of corneal complications with eyelid cicatricial pathologies in patients with Stevens–Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis syndrome. Ophthalmology. 2005;112(5):904–912. doi: 10.1016/j.ophtha.2004.11.035Schrader S, Notara M, Beaconsfield M, et al. Tissue engineering for conjunctival reconstruction: established methods and future outlooks. Curr Eye Res. 2009;34(11):913–924. doi: 10.3109/02713680903198045Shapiro MS, Friend J, Thoft RA. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1981;21(1 Pt 1):135–142.Makuloluwa AK, Hamill KJ, Rauz S, et al. Biological tissues and components, and synthetic substrates for conjunctival cell transplantation. Ocul Surf. 2021;22:15–26. doi: 10.1016/j.jtos.2021.06.003 EDN: CMBFXADrechsler CC, Kunze A, Kureshi A, et al. Development of a conjunctival tissue substitute on the basis of plastic compressed collagen. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(3):896–904. doi: 10.1002/term.1991Zhou H, Lu Q, Guo Q, et al. Vitrified collagen-based conjunctival equivalent for ocular surface reconstruction. Biomaterials. 2014;35(26):7398–7406. doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.05.024Lu Q, Al-Sheikh O, Elisseeff JH, Grant MP. Biomaterials and tissue engineering strategies for conjunctival reconstruction and dry eye treatment. Middle East Afr J Ophthalmol. 2015;22(4):428–434. doi: 10.4103/0974-9233.167818Witt J, Mertsch S, Borrelli M, et al. Decellularised conjunctiva for ocular surface reconstruction. Acta Biomater. 2018;67:259–269. doi: 10.1016/j.actbio.2017.11.054 EDN: WVOTEMAndreev AY, Osidak EO, Grigoriev TE, et al. A new collagen scaffold for the improvement of corneal biomechanical properties in a rabbit model. Exp Eye Res. 2021;207:108580. doi: 10.1016/j.exer.2021.108580 EDN: BHUXPJMerjava S, Neuwirth A, Tanzerova M, Jirsova K. The spectrum of cytokeratins expressed in the adult human cornea, limbus and perilimbal conjunctiva. Histol Histopathol. 2011;26(3):323–331. doi: 10.14670/HH-26.323Offeddu GS, Ashworth JC, Cameron RE, Oyen ML. Multi-scale mechanical response of freeze-dried collagen scaffolds for tissue engineering applications. J Mech Behav Biomed Mater. 2015;42:19–25. doi: 10.1016/j.jmbbm.2014.10.015Ahearne M, Yang Y, El Haj AJ, et al. Characterizing the viscoelastic properties of thin hydrogel-based constructs for tissue engineering applications. J R Soc Interface. 2005;2(5):455–463. doi: 10.1098/rsif.2005.0065Dunphy SE, Bratt JA, Akram KM, et al. Hydrogels for lung tissue engineering: Biomechanical properties of thin collagen-elastin constructs. J Mech Behav Biomed Mater. 2014;38:251–259. doi: 10.1016/j.jmbbm.2014.04.005Ilari L, Daya SM. Long-term outcomes of keratolimbal allograft for the treatment of severe ocular surface disorders. Ophthalmology. 2002;109(7):1278–1284. doi: 10.1016/s0161-6420(02)01081-3Kantor NB, Tovar A, Wang T, Galor A. How does ocular graft-versus-host disease fit under the dry eye umbrella? A review. Clin Exp Ophthalmol. 2024;52(2):167–185. doi: 10.1111/ceo.14347 EDN: SVKPDWAdewara B, Singh S. Severe cicatricial entropion repair using mucous membrane graft in Stevens–Johnson syndrome. Indian J Ophthalmol. 2022;70(12):4470. doi: 10.4103/ijo.IJO_1504_22 EDN: ADNWLJMai C, Bertelmann E. Oral mucosal grafts: old technique in new light. Ophthalmic Res. 2013;50(2):91–98. doi: 10.1159/000351631Fernandes M, Sridhar MS, Sangwan VS, Rao GN. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Cornea. 2005;24(6):643–653. doi: 10.1097/01.ico.0000151501.80952.c5Chen Z, Lao HY, Liang L. Update on the application of amniotic membrane in immune-related ocular surface diseases. Taiwan J Ophthalmol. 2021;11(2):132–140. doi: 10.4103/tjo.tjo_16_21 EDN: VVYYTRZhao H, Qu M, Wang Y, et al. Xenogeneic acellular conjunctiva matrix as a scaffold of tissue-engineered corneal epithelium. PLoS One. 2014;9(11):e111846. doi: 10.1371/journal.pone.0111846Chermnykh ES, Kalabusheva EP, Osidak EO, et al. Effect of high-density matrix on human skin dermal cell behavior in 3D constructs. Genes & Cells. 2019;14(3 Suppl.):253–253.Kanta J. Collagen matrix as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adh Migr. 2015;9(4):308–316. doi: 10.1080/19336918.2015.1005469Dodd NJ, Schor SL, Rushton G. The effects of a collagenous extracellular matrix on fibroblast membrane organization. An ESR Spin Label Study. Exp Cell Res. 1982;141(2):421–431. doi: 10.1016/0014-4827(82)90230-0da Rocha-Azevedo B, Grinnell F. Fibroblast morphogenesis on 3D collagen matrices: the balance between cell clustering and cell migration. Exp Cell Res. 2013;319(16):2440–2446. doi: 10.1016/j.yexcr.2013.05.003Eidet JR, Dartt DA, Utheim TP. Concise review: comparison of culture membranes used for tissue engineered conjunctival epithelial equivalents. J Funct Biomater. 2015;6(4):1064–1084. doi: 10.3390/jfb6041064Gattazzo F, Urciuolo A, Bonaldo P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochim Biophys Acta. 2014;1840(8):2506–2519. doi: 10.1016/j.bbagen.2014.01.010Akhmanova M, Osidak E, Domogatsky S, et al. Physical, spatial, and molecular aspects of extracellular matrix of in vivo niches and artificial scaffolds relevant to stem cells research. Stem Cells Int. 2015;2015:167025. doi: 10.1155/2015/167025 EDN: UZWXXLEngler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 2006;126(4):677–689. doi: 10.1016/j.cell.2006.06.044 EDN: XTVJIXDischer DE, Mooney DJ, Zandstra PW. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 2009;324(5935):1673–1677. doi: 10.1126/science.1171643Trappmann B, Gautrot JE, Connelly JT, et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 2012;11(7):642–649. doi: 10.1038/nmat3339 Erratum in: Nat Mater. 2012;11(8):742.