BACKGROUND: Cultivation of dorsal root ganglia (DRGs) is a widely used approach for modeling physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system in vitro. Existing scientific data indicates that postnatal DRGs contain a pool of glial stem cells capable of differentiating into neurons after injury. Therefore, isolated DRGs containing a stem cell pool may retain neurogenic potential ex vivo. However, no studies in the available scientific data have investigated the preservation of the regenerative potential of DRGs ex vivo.
AIM: This study aimed to evaluate the neurogenic potential of isolated DRGs and establish a three-dimensional organotypic culture from these explants.
METHODS: DRGs were isolated from the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spine and cultured short-term and long-term as three-dimensional explants in Geltrex gel. The morphology, ultrastructure, and gene expression profile of the cultured DRGs were analyzed using light and electron microscopy, immunofluorescent staining, and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.
RESULTS: DRGs cultured in Geltrex for 14 days consistently generated a three-dimensional periganglionic network composed of radially branching elongated cells. Immunofluorescent staining with Tuj1 antibodies (neuron-specific class III β-tubulin) demonstrated that the observed cells were neuronal. Immunostaining with O4 antibodies confirmed that Tuj1-positive cells were not migrating Schwann cells. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis of total RNA extracted from the DRG explant cultures revealed a significant increase in mRNA levels of key neurogenesis-related genes, such as Neurog1, Neurog2, and Sox2, indicating activation of a neurogenic program in the cultured explants. Light and electron microscopy showed that adult sensory neurons degenerated within the DRG explants and did not contribute to the periganglionic network. Using available confocal capabilities, we evaluated three-dimensional parameters of the periganglionic network from two-dimensional microscopic images to demonstrate the topography of Tuj1-expressing neuronal cells in a DRG explant culture.
CONCLUSION: We characterized a three-dimensional culture of DRGs. Isolated explants demonstrate regenerative capacity under in vitro conditions. They may represent a novel organotypic model with neurogenic potential. The obtained model may be relevant for studying regenerative processes in DRGs, expanding research opportunities beyond traditional stem cell–derived models.
Обоснование. Культивирование спинномозговых ганглиев является широко используемым подходом для моделирования физиологических и патологических состояний периферической нервной системы in vitro. Имеющиеся литературные данные указывают на то, что постнатальные спинномозговые ганглии содержат пул глиальных стволовых клеток, которые способны дифференцироваться в нейроны после травмы. Следовательно, извлечённые спинномозговые ганглии, содержащие пул стволовых клеток, могут обладать нейрогенным потенциалом ex vivo. Однако в доступной литературе мы не нашли работ, исследующих сохранение регенеративного потенциала спинномозговых ганглиев ex vivo.
Цель. В данном исследовании мы оценили нейрогенный потенциал изолированных спинномозговых ганглиев и создали трёхмерную органотипическую культуру из этих эксплантов.
Методы. Мышиные спинномозговые ганглии, выделенные из шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника, краткосрочно и долгосрочно культивировали в виде трёхмерной культуры в геле Geltrex. Морфологию, ультраструктуру и профиль экспрессии генов культивируемых спинномозговых ганглиев анализировали с помощью световой и электронной микроскопии, иммунофлуоресцентного окрашивания и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Результаты. Установлено, что спинномозговые ганглии, культивируемые в Geltrex в течение 14 дней, стабильно генерировали трёхмерную периганглионарную сеть, состоящую из радиально разветвлённых удлинённых клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против Tuj1 (нейронспецифический бета-тубулин класса III) показало, что наблюдаемые клетки были нейрональными клетками. Иммуноокрашивание антителами против O4 подтвердило, что клетки, маркированные Tuj1, не были мигрирующими Шванновскими клетками. Количественный анализ общей РНК, выделенной из культуры эксплантов спинномозговых ганглиев с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, выявил значительное увеличение матричной РНК ключевых генов, связанных с нейрогенезом, таких как Neurog1, Neurog2 и Sox2, что указывает на активацию нейрогенной программы в культивируемых эксплантах. Световая и электронная микроскопия показали, что взрослые сенсорные нейроны дегенерировали в эксплантах спинномозговых ганглиев и не вносили вклад в периганглионарную сеть. Используя доступные конфокальные возможности, мы оценили трёхмерные параметры периганглионарной сети по двумерным микроскопическим изображениям, чтобы продемонстрировать топографию нейрональных клеток, экспрессирующих Tuj1, в культуре эксплантов спинномозговых ганглиев.
Заключение. Охарактеризована трёхмерная культура спинномозговых ганглиев. Обнаружено, что выделенные экспланты демонстрируют регенеративную способность в условиях культивирования in vitro и могут представлять собой новую органотипическую модель с нейрогенным потенциалом. Полученная модель может быть релевантной для изучения процессов регенерации в спинномозговых ганглиях, расширяя возможности исследований за пределами традиционных двумерных культур, получаемых из стволовых клеток.