BACKGROUND: Cryopreservation is a widely used method for long-term viability preservation of cultured cells and complex cellular structures, including organoids, which serve both scientific and clinical purposes, as well as for screening applications. However, data on cryopreservation of organoids derived from differentiated induced pluripotent stem cells (iPSCs) remain limited.
AIM: The work aimed to optimize slow freeze protocols for neural organoids derived from iPSC-differentiated cells and chondrospheres.
METHODS: Neural organoids differentiated from iPSCs were cryopreserved on days 9, 14, 22, 29, and 43 using four different cryopreservation media. Post-thaw assessment included organoid integrity and size measurements, quantitative polymerase chain reaction for MAP2 and NES markers, and immunohistochemical (IHC) staining for βIII-tubulin, MAP2, SOX2, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
Chondrospheres were derived from human chondrocytes and cryopreserved 29 days after transition to 3D culture conditions in a solution of 82% DMEM + 10% FBS + 8% DMSO + 10 µM ROCK inhibitor Y27632 (Ri, Rho-associated protein kinase inhibitor). Post-thaw IHC analysis was performed to assess the expression of chondrogenic marker proteins, including aggrecan, collagen type II, and SOX9, as well as PCNA.
RESULTS: Neural organoids cryopreserved between weeks 3 and 6 of differentiation retained the highest post-thaw structural integrity. Although organoid diameter decreased by 14.5% on average 1 week after thawing, size was nearly restored to the values observed on the corresponding day of differentiation for organoids not subjected to cryopreservation by week 2. Quantitative polymerase chain reaction and IHC staining confirmed maintenance of neuronal phenotype 2 weeks post-thaw. Chondrospheres showed no change in diameter over 2 weeks post-thaw and exhibited 100% preservation of organoid integrity. IHC analysis confirmed the presence of chondrocytic proteins in chondrospheres 2 weeks after thawing.
CONCLUSION: Based on the study findings, the third week of differentiation was identified as the optimal stage for cryopreservation of iPSC-derived neural organoids. The cryopreservation medium composed of 82% DMEM, 10% FBS, and 8% DMSO was optimal for both neural organoids and chondrospheres.
Обоснование. Криоконсервация является широко применяемым методом длительного сохранения жизнеспособности культур клеток или сложных клеточных структур, включая органоиды, которые используются как для научных задач, так и в скрининговых исследованиях и клинической практике. Данных о криоконсервации органоидов на основе дифференцированных производных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в настоящее время недостаточно.
Цель. Оптимизация протоколов медленной криоконсервации нейральных органоидов из дифференцированных производных ИПСК и хондросфер.
Методы. Нейральные органоиды, полученные из дифференцированных в нейральном направлении ИПСК человека, на 9, 14, 22, 29 и 43-и сутки подвергали криоконсервации в четырёх вариантах растворов. После размораживания оценивали целостность и размеры органоидов, выполняли количественную полимеразную цепную реакцию на нейральные маркёры МАР2 и NES, а также иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание на бета-3-тубулин, МAP2, SOX2 и ядерный антиген пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen, PCNA).
Хондросферы получали из хондроцитов человека и криоконсервировали их через 29 дней после перевода в 3D-условия культивирования в растворе 82% DMEM + 10% FBS + 8% DMSO + 10 мкмоль ROCK-ингибитора Y27632 (Ri, Rho-associated protein kinase inhibitor). После размораживания проводили ИГХ-анализ на экспрессию хондрогенных маркёрных белков аггрекана, коллагена II типа и SOX9, а также на PCNA.
Результаты. Нейральные органоиды, замороженные на 3–6-й неделе от начала дифференцировки, показали наибольшее сохранение целостности после разморозки. Через неделю после разморозки диаметр нейральных органоидов уменьшался в среднем на 14,5%, однако ещё через неделю их размер практически достигал значений на соответствующий день дифференцировки для органоидов, не подвергавшихся криоконсервации. Количественная полимеразная цепная реакция, а также ИГХ-окрашивание показали сохранение нейрального фенотипа клетками нейральных органоидов через 2 нед после разморозки. Хондросферы в течение 2 нед после разморозки не демонстрировали изменений диаметра и показали 100% сохранение целостности органоидов. ИГХ-анализ продемонстрировал присутствие хондроцитарных белков в хондросферах через 2 нед после разморозки.
Заключение. По итогам исследования оптимальной стадией для криоконсервации нейральных органоидов на основе ИПСК можно считать 3-ю неделю от начала дифференцировки, а криопротекторный раствор 82% DMEM + 10% FBS + 8% DMSO — наиболее подходящим для заморозки. Этот раствор также подходит для криоконсервации хондросфер.