BACKGROUND: Mammalian cell cultures play a key role in the pharmaceutical industry, requiring constant monitoring of the cell conditions during fermentation. In addition to monitoring of the physical-chemical parameters, it is important to evaluate the transcription state of cells, for which gene expression analysis is used. Currently, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR) is the dominant method. However, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique also attracts attention due to its high specificity, sensitivity and reaction rate. LAMP is becoming a promising tool for rapid analysis of gene expression, especially under the conditions of limited biological material or a large volume of samples.
AIM: Development of a technique for semi-quantifying the expression level of target genes in human cell culture Expi293 using LAMP.
MATERIALS AND METHODS: For LAMP, a recombinant large fragment of Bacillus stearothermophilus DNA polymerase (Bst-pol) was obtained, purified, and optimal reaction conditions were determined. SYBR Green I and LUCS13 were used as intercalating dyes. The amplification parameters for different concentrations of the enzyme and the dye were analyzed. Standard SYBR Green I kits were used for qPCR. Both methods were compared when analyzing the expression of IGF1, FGF2 and EIF3i genes in cell lines with an increased expression level of these genes.
RESULTS: It has been shown that using LUCS13 dye provides the classic S-shape of the signal accumulation curve in LAMP, while using SYBR Green I dye causes artifacts. The optimal concentration of Bst-pol was 40 ng/µl. When comparing the two methods, it was found that LAMP has greater sensitivity, allows determining gene expression with an accuracy comparable to qPCR, demonstrating a shorter reaction time (up to 35 minutes).
CONCLUSION: Although qPCR remains the main method for assessing the level of gene expression, LAMP offers a number of advantages that make it an attractive alternative for various biotechnological purposes. Due to its high speed, ease of execution and accessibility, as well as high sensitivity and specificity, LAMP is a valuable technique for rapid analysis of gene expression during cell culture monitoring.
Обоснование. Клеточные культуры млекопитающих играют ключевую роль в фармакологической промышленности, требуя постоянного мониторинга состояния во время ферментации. Помимо контроля физико-химических параметров важно оценивать состояние клеток, для чего используется анализ экспрессии генов. В настоящее время доминирующим методом служит количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) с обратной транскрипцией. Однако метод петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) также привлекает внимание благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и скорости проведения реакции. LAMP становится перспективным инструментом для быстрого анализа экспрессии генов, особенно в условиях ограниченного количества биологического материала или большого объёма проб.
Цель исследования — разработка методики полуколичественной оценки уровня экспрессии целевых генов в культуре клеток человека Expi293 с помощью LAMP.
Материалы и методы. Для проведения LAMP был получен рекомбинантный большой фрагмент ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst-pol), выполнена его очистка и определены оптимальные условия реакции. В качестве интеркалирующих красителей использовали SYBR Green I и LUCS13. Проанализированы параметры амплификации для различных концентраций фермента и красителя. Для кПЦР использовали стандартные наборы с SYBR Green I. Обе методики сравнивали в процессе анализа экспрессии генов IGF1, FGF2 и EIF3i в клеточных линиях с повышенным уровнем экспрессии этих генов.
Результаты. Показано, что использование красителя LUCS13 обеспечивает классическую S-образную форму кривой накопления сигнала в LAMP, в то время как использование SYBR Green I приводит к её искажению (вызывает артефакты). Оптимальной признана концентрация Bst-pol 40 нг/мкл. При сравнении двух методов установлено, что LAMP обладает большей чувствительностью, позволяет определять экспрессию генов с точностью, сравнимой с кПЦР, демонстрируя более короткое время реакции (до 35 мин).
Заключение. Хотя кПЦР остаётся основным методом оценки уровня экспрессии генов, LAMP предлагает ряд преимуществ, которые делают её привлекательной альтернативой для различных биотехнологических целей. Благодаря высокой скорости, простоте выполнения и доступности, а также высокой чувствительности и специфичности LAMP является ценным инструментом для быстрого анализа экспрессии генов в ходе мониторинга клеточных культур.